Согласно ряду исследований, каждый из нас является носителем 2-3 мутаций, которые потенциально могут привести к рождению детей с генетическими заболеваниями, поэтому в преконцепционном периоде желательно проведение генетического скрининга, чтобы понимать риски и оценивать возможности. Не менее важным является преимплантационный генетический скрининг в программах ЭКО, поскольку позволяет переносить только эуплоидные эмбрионы и тем самым повышает частоту наступления беременности. В данной лекции пойдет речь о различных методиках секвенирования, их преимуществах и недостатках. Вы узнаете, как изменяется частота наступления беременности при использовании того или иного метода, частота абортов до 8 недель и частота многоплодной беременности.
ВЕБИНАР СЛЕДУЮЩИЙ
ВЕБИНАР
Тезисы
Важность генетических исследований в ВРТ
Корнилов Н.В.
Современные методы секвенирования (NGS) отличаются тем, что позволяют читать бóльшие части генома, в отличие от секвенирования по Сенгеру, например, где можно было анализировать лишь небольшой участок. Основные преимущества такого секвенирования проявляются в преконцепционном и преимплантационном скрининге, но также увеличились возможности и пренатального, постнатального и популяционного скринингов.
Процедура NGS (MPS)
1. Экстракция ДНК.
2. Создание библиотек.
3. Секвенирование.
4. Оценка существующих проблем.
Существует возможность исследования генома полностью, однако, это дорогостоящая процедура и не всегда нужна. Чаще всего используется таргетное исследование, экзома или его части. Экзом включает 22 000 генов, клинический экзом – 4 800, а часть экзома (парциальный экзом) – 500-100 генов, интересующих по конкретным заболеваниям.
На первом этапе проводится подготовка материала, наращивание ДНК, а затем ее анализ
Преконцепционный скрининг
Для исключения наследственных заболеваний у ребенка, первое – это необходимо знать персональный риск своего генома. Учитывая, что каждый из нас является носителем 2-3 мутаций, риск рождения больного ребенка присутствует у всех.
Каждое заболевание может быть спровоцировано разными мутациями в одном гене: выпадение участка, его дупликация и т.д. (если проводить аналогию с книгой, то ошибка может быть в выпадении предложения или целой главы, а также в лишних буквах и главах). И все эти варианты нужно найти, чтобы точно можно было установить диагноз. При этом важно понимать, что не каждая мутация может привести к клиническому проявлению какого-либо заболевания.
Моногенные заболевания и NGS
Обуславливают 20% детской смертности, 18% (10) педиатрических госпитализаций, и это трагедия отдельных семей. Поэтому внедрение NGS поможет избежать рождения таких больных детей.
Если провести аналогию с с. Дауна, то внедрение скрининга позволило резко снизить число детей, родившихся с этим диагнозом.
Преконцепционный скрининг был предложен в 1960 году, реальный старт в 2013 году с появлением секвенирования, а рост числа исследований в 2014-2016 гг. с удешевлением процедуры.
Результаты одного из исследований
В 2015 году в Испании было проведено ретроспективное исследование более 2500 генетических образцов (доноров и пациентов, использующих в программах как донорские, так и собственные клетки) Обнаружилось, что 5% пар имели патогенетические изменения высокого риска по 6 заболеваниям( из них 2% Х-сцепленных заболеваний), 25% риск возможного носительства, Из-за Х-сцепленных изменений. Лишь 7% из пациентов не несли каких-либо мутаций.
В ходе данного исследования, использовалась «широкая» панель, которая имеет ряд недостатков.
* Включает 623 заболевания – 549 генов (OMIM).
* Это затрудняет интерпретацию вариантов, определение клинически значимых и нет, частоту, разброс по базам данных, присутствует неизвестная значимость вариантов (только у одного муковисцидоза более 1000 значимых мутаций).
* Очень сложна валидация (48 образцов) из тысяч вариантов.
* Затруднена претестовая и посттестовая консультация из-за большого количества заболеваний и неизвестной значимости отдельных мутаций.
* Большие временные и денежные затраты.
* Малая глубина исследования при широком диапазоне.
Кому рекомендован преконцепционный скрининг?
* Доноры ооцитов и спермы. Создание криобанка с низким статусом носительства по генетическим заболеваниям.
* Тестирование будущих родителей в ВРТ.
* Тестирование будущих родителей в популяции.
* Тестирование популяции (при удешевлении процедуры).
Тест NextGen 21
Разработан клиникой NGS, включены Х-сцепленные заболевания, аутосомно доминантные и аутосомно рецессивные. Всего в панели 21 заболевание. Наличие 21 гена упрощает интерпретацию вариантов, делает валидацию осуществимой, а до и пост тестовое консультирование возможным. Скрининг проводится глубокий. Поэтому в панель исследования вошли заболевания, которые соответствовали следующим критериям.
* Высокая популяционная частота.
* Известная генетическая этиология.
* Высокая пенетрантность.
* Известный тип наследования.
* Тяжесть манифестации.
* Позднее фенотипическое проявление.
* Методические рекомендации.
Состав панели (заболевания): муковисцидоз, фенилкетонурия, спинально-мышечная атрофия, миотоническая дистрофия I типа, миодистрофия Дюшена, болезнь Хаттингтона, гемофилия А, бета-талласемия, серповидно-клеточная анемия, семейный аденоматозный полипоз I и II типа, мукополисахаридоз 1 типа, аутосомно-доминантный поликистоз почек I и II типа, болезнь Шарко-Мари-Тута, болезнь Гиппеля-Линдау, болезнь Вильсона-Коновалова, болезнь Гоше, болезнь Тея-Сакса, наследственный рак молочной железы и яичников I и II типа.
Преимплантационный скрининг
Почему нужен полный хромосомный преимплантационный скрининг (ПГС-ПХС)?
Большинство эмбрионов анеуплоидны и гибнут сразу или до 8 недель гестации (кроме 13, 18, 21, Х, Y, 16). Анеуплоидия самая частая причина неудач при ЭКО и самая частая причина прерывания беременности, а эмбрионы могут иметь сегментарные анеуплоидии или быть полиплоидными.
Целесообразность ПГС-ПХС – зачем нужна процедура?
* Повышение вероятности доношенной беременности и живорождения.
* Возможность переносить только один эмбрион и исключить двойни.
* Возможность не хранить анеуплоидные бластоцисты.
* Не переносить ненужное (эмбрионы, которые дадут больного ребенка или прерывание беременности).
* Сократить аборты и риски аномалий у детей.
* Сократить время до рождения ребенка и стресс. Этот пункт крайне важен, поскольку многократные потери беременности на ранних сроках или рождение больных детей увеличивает расходы и частоту попыток ЭКО или, напротив, потеряв надежду, женщина отказывается от дальнейших попыток. Также немаловажно сократить время до рождения ребенка у пациенток с низким овариальным резервом.
* Сократить расходы на рождение 1 ребенка.
* Перспективы дальнейшего развития скрининга.
История ПГС
В 1991-1995гг. появилась и стала внедряться FISH диагностика, но в 2011 году были опубликованы результаты мета-анализа, которые показали, что FISH диагностика не только не повышает вероятность рождения здорового ребенка, но и снижает имплантационную частоту на 39% (негативное влияние биопсии бластоцисты). На сегодня мы понимаем, что бипсию 3-го дня не стоит проводить из-за мозаицизма.
В 2010-2012 гг. появились методы qPCR, aCGH, SNP и стали исследоваться 24 хромосомы, что значительно улучшило результаты скрининга.
В 2013 году появление NGS. Постепенно с удешевлением методики ее стали использовать более активно. Возможно, в будущем будет проводится не только биопсия трофэктодермы, но и бластоцентез, исследование сред для культивирования, смогут быть подключены не только аутосомные, но и моногенные заболевания, митохондриальные, а также изучение длины теломер, тракскриптомики, микро РНК.
Кому можно рекомендовать ПГС-ПХС?
На сегодняшний день консенсус пока не достигнут. Существует три точки зрения.
1. Проводить ПГС женщинам старшего возраста, вступающих в программу ЭКО, поскольку у них риск анеуплоидий очень высок.
2. Проводить ПГС всем женщинам, поскольку и в молодом возрасте риск анеуплоидий составляет 30%, а это резерв для увеличения частоты наступления беременности.
3. Не проводить ПГС никому.
Данные различных исследований по перспективности ПГС в различных группах
Как среди молодых пациенток, так и у женщин более старшего возраста, так и среди женщин более старшего возраста, эффективность переноса одного тестированного эмбриона была почти идентична эффективности переноса двух не тестированных эмбрионов, но во второй группе частота многоплодных беременностей соответственно была значительной.
В группе женщин, прибегнувших к помощи суррогатных матерей, частота наступления беременности после переноса тестированного эмбриона составила 68%, а при переносе не тестированных двух эмбрионов – 38% (при этом частота многоплодной беременности – 35%, а частота прерываний беременности – 22%).
В донорских программах частота наступления беременности при использовании тестированного эмбриона – 73%, против 46% (без ПГС).
Эффективность ПХС на сегодня (данные 4 РКИ и 7 когортных): выше имплантационная частота и частота живорождения, ниже частота абортов и многоплодия.
NGS \ MPS для скрининга на анеуплоидию
Секвенирование: NGS и скрининг (тестирование) на анеуплоидию. Валидация метода в 2015 году.
Как работает NGS: фрагментация и амплификация миллионов маленьких фрагментов. Анализ количества копий – моно, ди, трисомия…
Внедрение NGS в практику клиники NGC (клиника Next Generation Clinic) (репродукции и генетики)
* Осознание необходимости перехода на NGS в 2013 году, закупка оборудования.
* Разработка правил трофэктодермы для секвенирования – источник контаминации ДНК в 2015 году.
* Валидация метода на биоптатах анеуплоидных aCGH (с разрешения этического комитета использовались аномальные эмбрионы).
* Верификация NGS на аликвотах WGA при несовпадении.
* Первые клинические результаты ПГС на 24 хромосомы с NGS и в 2016 г – 2-3 запуска в неделю – 70% циклов.
* Создание панели скрининга на моногенные заболевания для нашей популяции с применением секвенирования (NextGen21).
Отличия NGS и aCGH
Были проведены различные исследования, которые показали, что метод NGS является более точным и четче селектирует эмбрионы – позволяет выявлять мозаичные эмбрионы в отличие от аCGH. И при сравнении этих методик, в том числе и со случаями без ПГС, были получены следующие результаты.
1. Клинические беременности: NGS – 71%, аCGH – 53%, без ПГС – 42,5%.
2. Б-ти после 12 недель: NGS – 66,7%, аCGH – 50%, без ПГС – 34,7%.
3. Аборты: NGS – 6,7%, аCGH – 5%, без ПГС – 15,5%.
4. Двойни: NGS – 0%, аCGH – 5%, без ПГС – 29,3%.
Зачем переходить от aCGH к NGS?
В исследовании J.Grifo в 2015 году были проанализированы 50 абортов после переноса aCGH «эуплодных» эмбрионов. 52% из них оказались аномальными (5% триплоиды, 47% мозаики). Был сделан вывод, что при использовании NGS можно было бы избежать 54% абортов, а также огромное количество отрицательных результатов (среди не наступивших беременностей выявлено 26% мозаиков при помощи NGS, которые не обнаружены были aCGH).
NGS более строго и четко селектирует эмбрионы.
Преимущества NGS значительны: более точное определение мозаицизма, сегментарных анеуплоидий, более привлекательная цена, которая постепенно снижается, и методика имеет большие перспективы. NGS уступает aCGH лишь во временных затратах и сложности.
Мозаицизм NGS (по одной хромосоме)…
Мозаичные эмбрионы переносить можно, но во 2-ю или 3-ю очередь, а также в том случае, если был получен единственный мозаичный эмбрион.
Если обнаружен мозаицизм менее 20%, то вероятнее всего, речь идет о погрешностях аппаратуры и набор клеток эуплоидный. Переносить такой эмбрион можно.
При мозацизме 80-100%, вероятнее всего, речь идет об анеуплоидии, моносомии и трисомии.
Не рекомендуется переносить: трисомии + 13, 18, 21, 16, 15, 2, 7, Х, У; моносомии Х или У, а также сегментарные анеуплоидии.
Можно переносить: трисомии +1, 2 – 6, 8 – 12, 17, 19, 20, 22; моносомии.
Исходы родов после ЭКО – существующие проблемы
* После процедуры ЭКО при одноплодной беременности, выше частота преждевременных родов и рождения маловесных детей, чем при спонтанной одноплодной беременности.
* При переносе свежих эмбрионов после ЭКО, частота преждевременных родов выше, чем при криопереносе. Это дает основание полагать, что тот уровень эстрогенов, который формируется при стимуляции не является оптимальным для формирования хориона и плаценты.
* При ЭКО повышается частота врожденных пороков.
* Обзор 38 исследований по соматической патологии детей после ЭКО показал, что выше риск неспецифических инфекций, паразитозов, генитоуринарных заболеваний, эпилепсии и судорожного синдрома (возможно ввиду маловесности) и астмы. Онкологический риск не подтвержден, однако выше риск в 3 раза по специфичным заболеваниям – ретинобластома и лейкемия. Возможно, эти факты связаны с более высокой тревожностью пациенток после ЭКО и большим количеством диагнозов.
* Осложнения после ЭКО: многоплодная беременность (частота в РФ – 23%, а в популяции должно быть не выше 5%); СГЯ (это осложнение которого не должно быть вообще!); кровотечения; эктопические беременности.
ЭКО по ОМС
ЭКО в системе ОМС – это не совсем эффективное направление, поскольку в нее часто попадают женщины, которым процедура не показана или они бесперспективны. В части клиник, пациентки, действительно нуждающиеся в ЭКО, не принимаются (чтобы не снизить показатели), а частота многоплодных беременностей слишком велика по причине погони за показателями ЧНБ, либо по причине отсутствия криопрограмм.
Эффективность ПГС
ЭКО – это не идеальная процедура и ПГС может снизить частоту осложнений (многоплодие, СГЯ), сократить время до наступления беременности и родов, исключить перенос анеуплоидных эмбрионов и т.д. Но важно понимать, что ПГС – это тестирование трофэктодермы бластоцисты, но не лечение анеуплоидии.
Вопросы
Считаете ли Вы необходимым введение ПГС в систему ОМС для носителей хромосомных патологий?
Да, это было бы разумным решением, поскольку процедура является дорогостоящей и не под силу всем парам.
Стоимость панели? Как донести до акушеров-гинекологов необходимость проведения ПГС?
Стоимость около 29 000 рублей. Нежелание использовать ПГС больше связана с финансовыми вопросами, но постепенно процедура все чаще внедряется в практику.
Спасибо за лекцию. Н В как всегда увлекательно и аргументированно
ответить