ЭКО в России. Культивирование эмбрионов человека

Хилькевич Л.В.

В 1978 году в Англии родился первый ребенок «из пробирки» в мире (доктор Р. Эдвардс и П.Стептоу).

Первая беременность после оплодотворения яйцеклеток invitro в СССР была получена во ВНИЦ по охране здоровья матери и ребенка МЗ СССР (1986г.) при очень бедном техническом оснащении (так, например, в качестве ламинарного бокса служил кювез для новорожденных с вырезанными отверстиями и помещенным в него микроскопом).

Приготовление среды по модифицированной методике A. Lopata (1980 г)

* Трижды дистиллированная вода.

* Ham^,sF-10 + Na-пируват, Са-лактат, Na-бикарбонат, Mg-сульфат, пенициллин.

* рН=7,2-7,4 при 5% СО2 в воздухе.

* Осмолярность 275-280 мОсм\кг

* Фильтрация через антибактериальный фильтр.

* Хранение: 7-10 дней при температуре +4⁰С.

* Источник протеинов: преовуляторная сыворотка крови пациентки или пуповинная сыворотка новорожденных, инактивированная при 55-56⁰С в течение 30 минут.

После получения первой беременности, лаборатория была профинансирована и переоснащена. Стала применяться первая готовая культуральная среда для эмбрионов (MenezoB2). Она использовалась вплоть до 90-х годов, поскольку являлась моноступенчатой богатой средой. И хотя среда была предназначена для культивирования эмбрионов до 3-х суток, бластоцисты хорошо развивались даже при культивировании в ней до 5 суток.

Кварцевая культуральная чашка, аналогов, которой нет в мире, была предложена С.И. Никитиным и изготовлена на Ленинградском оптико-механическом заводе. Она идеально подходила для культивирования в отсутствие нетоксичных пластиковых чашек.

После переоснащения стали использовать многоразовые катетеры Tom-Cat, которые применяются в некоторых клиниках и по сей день.

Первый успешный протокол. Май 1985

* Стимуляция суперовуляции: клостилбегит + пергонал.

* Лапароскопическая пункция 8 фолликулов.

* Получено 3 преовуляторных и 1 незрелый ооцит.

* Среда дозревания: 50% СО2 в воздухе, 37⁰С, 90% влажности.

* Культуральная чашка: «кварцевая солонка».

* Через 6 часов дозревания перенос 3 зрелых ооцитов в среду оплодотворения: Ham^,sF-10 + 10% термоинактивированной сыворотки крови пациентки.

* Обработка спермы: двойная отмывка + Swim-up.

* Оплодотворение методом IVI (10⁶ сперматозоидов на мл среды).

* Через 17 часов 3 зиготы перенесены в среду дробления (Ham^,sF-10 + 20% гомологичной сыворотки крови).

* Инсеминация 4-го ооцита через 28 часов дозревания.

* Через 48 часов культивирования 8 июня 1985 г. – трансцервикальный перенос 2-х эмбрионов на стадии 3-х бластомеров и одной зиготы (из дозревшего ооцита) в 50 мкл среды.

* Среда переноса: Ham^,sF-10 + 50% гомологичной сыворотки.

7 февраля 1986 года на 35 неделе беременности путем кесарева сечения родилась первая девочка ЭКО в СССР. Перед извлечением ребенка был проведен тщательный контроль с подтверждением абсолютного трубного бесплодия и исключением вероятности наступления самостоятельной беременности.

Первая публикация об успешных родах появилась лишь в 1988 году.

Для сравнения: у Р. Эдвардса в 1983 году – 139 родов, в 1986 году – 1000 родов, дополнительно к 1986 году в мире – более 1000 родов.

Первые близнецы в стране родились 6 августа 1986 года после переноса одного эмбриона на стадии 4 бластомеров (стимуляция клостилбегит).

Частота наступления беременности в первых стимуляционных циклов (различные комбинации) не превышала 5-7%. С началом использования Хумегона в длинном протоколе с декапептилом частота наступления беременности повысилась до 28%.

Если сегодня в большинстве клиник переносится один эмбрион на стадии бластоцисты, в те годы в среднем переносилось 5 дробящихся эмбрионов для получения одной беременности.

Первые трансвагинальные пункции стали проводится с января 1987 года.

Слагаемые успеха на лабораторном этапе

* Культивирование эмбриона в новых поколениях последовательных и моноступенчатых сред с уникальными защитными комплексами.

* Стабильные условия культивирования в планшетных мини-инкубаторах с тройной газовой смесью (5% О2, 6% СО2, 89% N2).

* Использование технологий IMSI, PICSI при тяжелом мужском бесплодии для отбора зрелых качественных сперматозоидов.

* Витрификация ооцитов, эмбрионов, ткани яичника (95-100% выживаемости).

* Time-lamse микроскопия. Однако остается много вопросов касательно преимущества этого метода для культивирования эмбрионов человека.

Диагностика генетических нарушений эмбриона до момента переноса. Программы PGD\PGS

Хромосомные аномалии становятся причиной 55-70% спонтанных абортов 1 триместра и 0,5-1% заболеваемости новорожденных.

Многие авторы сходятся во мнении, что показания для проведения PGD не нужны, поскольку даже у молодых женщин до 25 лет риск анеуплоидий достигает 30%.

По данным работы Капальбо (совместное двуцентровое исследование) частота имплантации эуплоидныхбластоцист не зависит от морфологии и срока развития (бластоцисты 5 и 7 дня, а также с хорошей или плохой морфологией имплантируются одинаково). Это дополнительный путь увеличения частоты живорождений в циклах с ПГС.

Стратегия безопасности в ПГД-циклах. Цель: рождение здорового ребенка

* Биопсия трофэктодермы всех экспандированныхбластоцист, независимо от морфологии и скорости их развития на 5-7 сутки культивирования.

* Полный хромосомный скрининг (24 хромосомы).

* Витрификация биопсированныхбластоцист.

* Перенос одной эуплоиднойбластоцисты в криоцикле.

Такая стратегия позволяет повысить частоту имплантации у пациентов с высоким риском хромосомной патологии до уровня группы с хорошим прогнозом и избежать нежелательной многоплодной беременности.

Современные молекулярные методы анализа

* Сравнительная геномная гибридизация (CGH).

* NGS – методы секвенирования нового поколения, позволяющие получать результаты с более низким шумом по сравнению с CGH. И они более информативны по частичным делециям, дупликациям и мозаицизму. Однако, обнаружение мозаицизма требует консультации молекулярных генетиков, поскольку в 30-40% случаев в этих ситуациях можно получить здоровый эмбрион.

Детальный анализ патологии эмбрионов методом NGS в разных возрастных группах показал, что частота встречаемости аномалий хромосом 15,16,21 и 22 была выше по сравнению с другими хромосомами. Частота анеуплоидии была выше в группе старше 40 лет и составляла почти 84% (в группе до 35 лет – 50%).

Хэтчинг

Использование вспомогательного лазерного хэтчинга достоверно не изменяет результаты и не увеличивает частоту наступления беременности в криоциклах.

Реэкспансия бластоцист после размораживания

Мы не ожидаем реэкспансии, поскольку используем криотоп метод витрификации, при котором выживаемость составляет почти 100%. Работа, проведенная нами в 2013-2014 гг. показала, что эмбрион, не демонстрирующий реэкспансии через час после размораживания, дает меньшую частота наступления беременности (она составляет порядка 25%), поэтому при наличии единственного эмбриона у женщины, он может быть перенесен.

Рабочая классификация морфологии бластоцист в ПМЦ

Используется буквенная классификация бластоцист по внутриклеточной массе (ICM) и трофэктодерме(ТЕ) – А, В, С, но нам принципиально важно разделить бластоцисты категории С – на С и D (почти отсутствует внутриклеточная масса и трофэктодерма). Мы не работаем с бластоцистами класса D.

Согласно результатам собственного исследования:

*бластоцисты класса С по ICM (всего несколько клеток или небольшой тяж) с ТЕ класса А+В, дают меньшую частоту имплантации – 22,7% и частоту прогрессирующих беременностей – 19,1%, но не 0%;

* бластоцисты класса С по ТЕ и класса А+В по ICM дают частоту имплантации – 30,1%, а частоту прогрессирующей беременности – 28%;

* по бластоцистам класса С-С по ICM и по ТЕ долгое время не удавалось получить положительных результатов, однако, в этом году после 12 переносов получили одну прогрессирующую беременность, что дает шанс на получение беременности у пациенток, у которых такой эмбрион был единственным.

Частота анеуплоидий бластоцист в циклах PGS

* В группе бластоцистах хорошего качества (АА\АВ и ВА\ВВ) частота эуплоидий – 41,3%, анеуплоидий – 58,7%.

* В группе бластоцистах категории АС/ВС частота эуплоидий – 38,5% и анеуплоидий – 61,5%.

* В группе бластоцистах СС из трех биопсированных бластоцист две оказались эуплоидными.

Удаление фрагментов как стратегия повышения выживаемости бластоцист

У некоторых эмбрионов плохого качества часть клеток не принимает участие в компактизации. Zona pellucida в процессе культивирования становится твердой и тормозит развитие эмбриона. Применение лазерного хэтчинга в этом случае с последующим удалением фрагментов повышает вероятность имплантации и наступления беременности.

Собственные результаты – 82 эмбриона с удаленными фрагментами

* Выросших до бластоцисты – 55 (67%).

* Переносы – 18.

* Имплантация – 42%.

* Частота беременности – 44,4%.

Сегодня в мире живет уже более 6 млн. «детей из пробирки».

Вопросы

Особенности криотоп метода витрификации?

Это быстрое замораживание эмбрионов с использованием высоких концентраций криопротекторов. Позволяет избежать образования кристаллов, происходит стеклование криорастворов. Автор метода подверждает 100%-ую морфологическую выживаемость даже после 28-кратной витрификации одного и того же ооцита. Практически все переносы в нашей клинике мы проводим в криоциклах, поскольку стимуляция негативно сказывается на рецепции эндометрия.

Как называется ваша клиника?

Перинатальный медицинский центр г. Москвы

Используете ли вы одноступенчатые среды?

Среда LifeGlobal пока не зарегистрирована в России. Мы работаем на средах Vitrolife, и с 2009 года на ней не получили ни одного провала в культивировании. Это среда с гиалуроном и мощным защитным комплексом. Была разработана Д.Гарднером.