Пренатальное неинвазивное ДНК-тестирование все шире входит в клиническую практику, и возможности тестов расширяются. Так, в октябре 2017 года тест Панорама включил несколько новых опций, что расширило возможности исследования и снизило количество ограничений для анализа. О том, какие новые опции включены и какие возможности они раскрывают и идет речь в этом вебинаре. А именно: исследование при двуплодной беременности с определением зиготности близнецов; отдельный анализ генотипов двух дизиготных близнецов; исследование при биологическом неродстве беременной и плода (донация ооцитов, суррогатное материнство). Расширенная технология позволяет наиболее точным образом провести исследование и расчитать риски по хромосомным анеуплоидиям для дизиготных близнецов, Определение зиготности позволяет в раннем сроке определить группу высокого риска по тяжелому осложнению - развитию ФФТС (фето-фетального трансфузионного синдрома).
ВЕБИНАР СЛЕДУЮЩИЙ
ВЕБИНАР
Тезисы
Кречмар М.В.
Рекомендации ESHG и ASHG (март, 2015)
Неинвазивный пренатальный ДНК-тест (ДНК-НИПТ) может стать основой пренатального скрининга. При наличии практики государственной поддержки пренатальных исследований рекомендовано включение ДНК-тестирования плода по крови матери в программу пренатальных исследований при поддержке государства.
В России пока нет такой практики, однако, проведено уже более 18 000 ДНК-НИПТ (Panorama) c 2013 по 2017 годы. Все они выполнены по добровольному выбору беременных на основе информирования женщин и рекомендаций врачей.
Был установлен ряд ануплоидий, но более 17 500 семей получили положительную информацию, существенно снижено количество инвазивных вмешательств.
Возможность выполнения ДНК-НИПТ на территории России
Лаборатория Геномед была лицензирована на выполнение теста Panorama на территории РФ (ранее все образцы направлялись в США). После валидации на территории России уже выполнено около 1 000 тестов.
Ключевые проблемы пренатальной диагностики (возраст/УЗИ/БХС)
* Не все плоды с с.Дауна имеют отклонения, видимые при УЗИ и изменения концентраций РАРР-А и ХГЧ.
* Дети с с.Дауна рождаются в группе низкого риска.
* Диагностика хромосомной патологии плода – проводится только в группе высокого риска и не может быть рекомендована всем беременным.
* Эффективность пренатального скрининга трисомий имеет технологические ограничения.
* Каждый 5 случай трисомии 21 не может быть выявлен при комбинированном скрининге
Важно понимать, что нельзя полностью исключить с.Дауна по данным УЗИ. Метод лишь выявляет особенности фенотипа плода, характерные для хромосомной аномалии, они могут и не проявиться на момент исследования. Более того эти маркеры имеют непостоянный характер, зависят от срока беременности и их выявление зависит от квалификации оператора.
Биохимический скрининг является еще более слабоинформативным методом. Уровень белков плода в крови матери зависит от очень многих факторов и может быть неверно интерпретирован.
По заключению ISPD в 2016 году, максимальная выявляемость с.Дауна при комбинированном скрининге не может превышать 79%.
Пренатальное исследование плода: как эффективно и безопасно снизить риски
Тестирование ДНК плода из крови беременной является прямым исследованием генетических структур и рекомендуется как инструмент скрининга.
Возможности скрининга при исследовании плодной ДНК
* Трисомии 21, 13, 18, количественные нарушения X, Y хромосом.
* Микроделеции – небольшие участки хромосом 1, 5, 15 и 22.
* Триплоидии и детекция генетического профиля второго замершего плода.
Инновации технологии Панорама (октябрь 2017)
* Исследование при двуплодной беременности с определением зиготности близнецов.
* Отдельный анализ генотипа дизиготных близнецов.
* Исследование при биологическом неродстве беременной и плода (донорский ооцит, суррогатное материнство).
Подавляющее большинство международных профессиональных сообществ рекомендуют ДНК-НИПТ как скрининговый метод первой линии для массового использования. Может быть предложен всем женщинам, независимо от группы риска.
Почему ДНК-НИПТ может быть рекомендован для организации скрининга почти всем беременным?
* Риск ХА (хромосомных аномалий) есть у всех и при каждой беременности.
* Тест безопасен.
* Выполняется на ранних сроках – с 9 недель, рекомендован как тест первой линии.
* Снижает количество инвазивных процедур в 10 раз и риск потерь беременности после них.
* Дает дополнительные опции для ведения беременности.
* Обеспечивает информированный комфорт.
* Экономически оправдан при массовых исследованиях.
Алгоритм проведения ДНК-НИПТ
* Получение биообразца – кровь беременной, в плазме которой обнаруживаются ДНК самой женщины и плода.
* Исследуется фрагментарная ДНК обоих (50% сходства).
Определяется процент плодной ДНК
* На основе секвенирования проводится анализ генома и оценка количества ДНК, соответствующего отдельным хромосомам.
НО! Нельзя объединять все ДНК-НИПТ. Они имеют разные технологии и алгоритм расчетов, соответственно точность и надежность результатов также отличается.
Существуют 2 подхода
1. Количественная оценка генетического материала некоторых хромосом без учета их происхождения (плодные или материнские).
* Массивное параллельное секвенирование.
* Таргетное секвенирование.
2. Идентификация и анализ отдельных хромосом плода\плодов
* Таргетное секвенирование + SNP (однонуклеотидные полиморфизмы)
В настоящее время валидированы три методики тестирования: S-MPS, T-MPS и SNP. Но каждая из них дает различное число ложных результатов. И если сравнить их между собой, выявляемость патологии при использовании SNP выше, чем суммарная у S-MPS и T-MPS .
Анализ количественных отклонений технологий S-MPS и T-MPS по общей св. ДНК
Мы получим неверный результат в следующих случаях:
* замершая беременность;
* второй замерший плод имел ХА (хромосомные аномалии);
* триплоидия;
* кариотип матери 47, ХХХ или мозаичный по количеству половых хромосом;
* онкологический процесс (клетки разного генотипа в организме матери).
SNP
Метод способен четко разделить плодную и материнскую ДНК и вести анализ хромосом по плодной ДНК. Основан на определении однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) в цепи ДНК, которые уникальны для каждого человека, тем самым точно определяя ДНК плода.
Преимущества идентификации разных индивидов
* Разделение генетического материала хромосом матери и плода.
* Идентификация плодных хромосом 21, 13, 18 и оценка их количества.
* Точное детектирование половых хромосом, количества X и Y.
* Оценка отдельных участков хромосом – микроделеций.
* Выявление дополнительного генома – второго замершего плода или триплоидии.
* Обнаружение присутствия иного генетического клона (трансплантат или онкоклон матери, возможно, фетальная опухоль плода).
Инновации 2017 года
Идентификация не только 2-х, но уже и 3-х разных индивидов (мать-плод-плод или мать-мать-плод) и позволяет расширить возможности пренатальных исследований.
* Определение зиготности близнецов – наличие одного или двух генотипов плодного происхождения.
* Определение % ДНК для каждого дизиготного близнеца.
* Оценка рисков трисомий для каждого близнеца из дизиготной пары
* Выявление нарушений числа хромосом у плода биологически неродственного беременной (ЭКО – ДО и СМ).
ДНК-НИПТ, основанный на SNP показывает меньший уровень (в 7 раз меньше) ложноположительных результатов для 21, 18 и 13 хромосом, чем другие технологии.
Фетальная фракция (ФФ)
Это основа теста Панорама
* Количество ДНК плода в крови прогрессивно увеличивается со сроком беременности.
* Между 10 и 22 неделями беременности в среднем определяется 10-12%.
* Уровень ФФ зависит от срока беременности (размеров плода), веса матери, особенностей плаценты и течения беременности.
* Минимальный уровень плодной ДНК для анализа Панорама составляет 2,8%.
Точная оценка плодной фракции позволяет выполнить тест в ранние сроки. Измерение фетальной ДНК является основным качественным показателем, необходимым для достоверной интерпретации результатов теста.
Низкая плодная фракция– это важный клинический сигнал
* Низкий % плодной ДНК – тест не может быть выполнен (менее 2,8%) или выполнен в неполном объеме.
* Исследования показывают увеличенный риск ануплоидий при низком % плодной ДНК. Особенно повышается риск трисомии 18 и 13.
* При низком % плодной фракции возможно назначение инвазивной диагностики и\или повторный ДНК-тест
* Низкая и очень высокая фракция – повышенный риск акушерской патологии (хорион-плацентарные нарушения).
Идентификация и анализ половых хромосом плода на основе SNP
* Генетический пол плода – идентификация половых хромосом плода.
* Основная задача – исключить синдром Тернера (моносомия Х).
* Определить хромосомный пол плода для подтверждения фенотипическому соответствию по УЗИ.
* Исключить синдромы полисомии половых хромосом: 48,ХХХ; 48,ХХХY с тяжелыми клиническими последствиями.
* Исключить синдром 47, ХХY; идентифицировать 46, ХХY; 47,ХХХ.
* Тест может быть назначен для определения пола плода при Х-сцепленных заболеваниях.
* Важно – оценка клинических последствий и консультирование родителей.
Триплоидия выявляется только по SNP. Почему это важно
* Хотя в большинстве случаев происходит выкидыш, частота встречаемости на 10 неделе составляет 1:1000 и не все случаи выявляются на УЗИ в 12 недель.
* Триплоидия отцовского происхождения – пузырный занос (риск для здоровья женщины).
* Триплоидия материнского происхождения может повторяться при следующих беременностях.
* При ЭКО наблюдаются триплоидии материнского и отцовского происхождения.
* ДНК-тест выявляет триплоидию с 9 недели.
* Рекомендовать тест Панорама, если триплоидия была при предыдущих беременностях.
Тест Панорама выявляет
Основной скрининг
* Трисомии 21, 18, 13.
* Моносомия Х.
* ХХХ, ХХY, ХYY.
* Триплоидия.
* Полная молярная беременность.
* Пол плода по желанию.
Расширенный скрининг
* 22q11.2 делеция.
* С-м Прадера-Вилли.
* С-м Ангельмана.
* С-м кошачьего крика.
* 1р36 делеция.
Новые возможности – оценка количества хромосом каждого плода при дизиготной беременности, что позволяет четко определить пол каждого плода и риски для каждого плода.
Алгоритм исследований
Первый этап – УЗИ в 9-10 недель
* Наличие беременности, количество плодов.
* Наличие живого плода\плодов.
* Наличие второго и более замершего плода.
* КТР плода\плодов (25 мм).
* Сердцебиение (наличие СБ и частота).
* Полярность, визуализация головы и туловища плода\плодов.
* Отсутствие грубых нарушений строения головы и тела плодов.
* Хориальность.
Второй этап – ДНК-НИПТ
ДНК-НИПТ при двуплодной беременности
Монозиготные близнецы имеют схожий генотип, дизиготные – два разных. И используемые ранее технологии не позволяли точно определить к какому плоду относится обнаруженная патология, особенно если процент плодной ДНК низкий.
Новые технология Панорама позволяет разделить генотипы матери и плодов
* Зиготность определяется путем сравнения полиморфизмов. По результату проводится оценка хромосомного материала по разным алгоритмам: материнская ДНК и плодная ДНК; материнская ДНК + ДНК одного плода + ДНК второго плода.
* Определяются половые хромосомы каждого плода при дизиготной беременности (пол одинаковый и разный).
* Определение зиготности включено в предварительный риск, сообщается в отчете.
Результаты исследований по информативности теста Панорама в определении анеуплоидий при двуплодной беременности
Трисомия 21: ДНК-НИПТ обладает высокой чувствительностью и специфичностью.
Трисомия 18: результаты скрининга менее показательны, чем по Т21 (часто по причине слишком низкой фетальной фракции).
Трисомия 13: эффективность скрининга не может быть определена, поскольку исследовано только 3 случая.
Тем не менее была проведена валидация теста Панорама: 137 образцов двуплодных беременностей. Установлена способность теста определять:
* риск отдельных анеуплоидий;
* зиготность;
* пол плода каждого близнеца.
Проведение скрининга на анеуплоидии, как и определение зиготности возможно, если фетальная фракция каждого из двойни 2,8% и более. Обновленный тест Панорама – единственный из всех ДНК-НИПТ, который способен определить зиготность и анеуплоидии при двуплодной беременности.
Зиготность и хориальность
Их определение является очень важным, поскольку определяет акушерские риски.
* 70% дизиготные и 30% монозиготные близнецы.
* 45% всех двоен имеют одинаковый пол плода, что не дает возможности определить зиготность по УЗИ.
* Встречаемость дизиготной двойни варьирует в разных популяциях.
* Монозиготные двойни встречаются одинаково часто: 3-5 на 1000 новорожденных.
* Монозиготная двойня после ЭКО возникает в 0,6-12,5%.
Определение хориальности – это оценка акушерских рисков
* Диагностические критерии: по данным УЗИ тип хориальности необходимо определить до 14 недель беременности (предпочтительно раньше).
* Оценивается: количество плодных яиц, наличие амниотической мембраны.
* Достоверно и однозначно определить тип хориальности с помощью УЗИ в большинстве случаев невозможно.
* 20% всех близнецов являются монохориальными, 75% из них имеют осложнения по причине нарушений плацентарного кровоснабжения. Самое грозное осложнение – фето-фетальный трансфузионный синдром.
Пренатальный ДНК-тест позволяет уже в раннем сроке – в 9-11 недель с высокой точностью определить зиготность двойни и выявить группу риска по развитию ФФТС и изменить акушерскую тактику.
Клиническое значение определения зиготности в ИПД
В случае выявления ХА по ДНК-НИПТ у близнецов, определение зиготности дает возможность определить тактику проведения инвазивного забора плодного материала.
При монозиготной двойне – достаточно одного образца хориона\плаценты\АЖ, тогда как при дизиготной двойне необходимо найти возможность достоверно получить образцы разного происхождения или при наличии ВПР и УЗ маркеров нацелиться на исследование конкретного плода.
Показания для ДНК-тестирования плода как следующего этапа после ДНК-тестирования эмбриона
Программы ЭКО все чаще используют преимплантационную генетическую диагностику различными методами, однако, существует остаточный риск – хромосомная патология плода не может быть исключена по причине мозаицизма и малого количества исследуемых клеток. Тогда выходом становится продолжение исследования в пренатальный период – ДНК-НИПТ.
Причины, требующие проведения ДНК-НИПТ после ПГД
* Риск с.Дауна и нарушений числа 13, 18, Х, Y хромосом плода есть при каждой беременности.
* ПГД проводится только на 1-5 клетках.
* Пациентки программ ВРТ – группа риска по возрасту.
* Осложненный акушерско-гинекологический анамнез.
* Сохраняющая терапия влияет на уровни гормонов, поэтому БХС малоинформативен.
* Часть беременных – группа риска по невынашиванию – имеют противопоказания к ИПД.
* Высокие ожидания положительного результата при беременности ВРТ родителями.
Новый алгоритм дородовой диагностики хромосомной патологии при применении ВРТ
1. Полногеномное ДНК-тестирование эмбриона.
2. УЗИ в 9 недель беременности.
3. Пренатальный скрининговый ДНК-тест. При высоком риске ХА – инвазивная диагностика + кариотип, ХМА, секвенирование.
4. При нормальном ДНК-НИПТ – УЗИ в 12, а затем в 20 недель. При высоком риске ХА – инвазивная диагностика + кариотип, ХМА, секвенирование.
Важно: тест Панорама с высокой долей вероятности определяет риск ХА, однако при сложной комбинации генотипов: ММП (мать – мать - плод) или МПП (мать – плод - плод), расширенная панель не исследуется, определяются только риски основных триплоидий.
Ограничения теста Панорама – когда тестирование не рекомендуется
* Беременность с установленным вторым замершим плодом.
* Беременной после трансплантации костного мозга.
* Многоплодной беременности: тройни и большое количество плодов.
* Многоплодной беременности с донорскими ооцитами и при вынашивании суррогатной матерью двух плодов.
Современный алгоритм обследования плода
* УЗИ в 9-10 недель.
* 9 недель – тест по плодной ДНК.
* УЗИ в 12-13 недель.
* УЗИ в 20-22 недели.
* УЗИ в 32 недели.
Выводы
Тестирование плодной ДНК по высокоинформативной технологии на основе SNP
1. Позволяет с высокой точностью определять и выявлять:
* частые анеуплоидии аутосом: Т21, Т18, Т13;
* нарушения числа половых хромосом;
* частые микроделеции;
* триплоидию;
* генетический пол плода;
* зиготность близнецов.
2. Проводить исследования в группах:
* повышенного и низкого риска ХА;
* при двуплодных беременностях с определением зиготности близнецов;
* при биологически неродственном плоде (ДО или СМ).
3. Снизить количество ИПД:
* определить акушерскую тактику при беременности МЗ близнецами;
* эффективнее проводить ИПД при двуплодной беременности.
Вопросы
Возможно ли проведение теста Панорама при тройне?
Нет, поскольку необходимо исследование 4-х генотипов. Возможно, в будущем такая диагностика будет проводится.
Предусматривает ли данный тест на анеуплоидии и определение отцовства?
Нет. Тест на анеуплоидии и тест на отцовство – это два разных теста, но они могут быть проведены параллельно.
Можно ли определить резус-фактор при помощи данного теста?
Нет. Для определения резус-фактора существует другое генетическое исследование.
Определяет ли данный тест пол плода?
Тест Панорама четко детектирует половые хромосомы. На более поздних сроках по УЗИ данные могут расходиться, что свидетельствует о серьезных состояниях, при которых фентопический и генетический пол не соответствуют.
Если провести тест Панорама до УЗИ, покажет ли он наличие двуплодной беременности?
Да. Но алгоритм тестирования при одноплодной и двуплодной беременности отличается, и при обнаружении генотипа второго плода, программа заменяется на близнецовую. Поэтому необходимо иметь четкое представление о количестве плодов перед началом тестирования.
Если тест Панорама определяет кариотип плода, почему он скрининговый, а не диагностический и требует обязательно ИПД после выявления патологии?
ДНК-тест определяет не кариотип плода, и исследует часть хромосом молекулярным методом, а для постановки диагноза необходимо использовать все методы диагностики, позволяющие получить максимально полную информацию. Ложные результаты теста могут быть связаны с мозаичностью, по той причине, что в кровотоке матери циркулируют ДНК из хориона. Именно поэтому при ИПД необходимо проведение амниоцентеза, а не биопсии хориона.
По результатам биопсии хориона был обнаружен с.Дауна. Пациентка отказывается прерывать беременность, т.к. не верит результатам, желает сдать тест Панорама. Есть ли в этом смысл?
Частота ложноположительных результатов при биопсии хориона 1:200 (связано с мозаичностью), поэтому важно оценить фенотипические проявления по данным УЗИ. При их отсутствии для получения всех возможных данных о состоянии плода возможно проведение теста Панорама.
Если на сроке 10-12 недель возникла угроза прерывания, а на УЗИ не выявлено маркеров ХА, возможно ли проведение теста Панорама после стабилизации пациентки?
Да. При наличии угрозы прерывания беременности, проведение ИПД не представляется возможным, поэтому целесообразно тестирование при помощи ДНК-теста. Стабилизации пациентки дожидаться не нужно (состояние женщины и лечение не влияют на результаты исследования), возможно угроза прерывания связана с ХА плода.
В программах ВРТ (ЭКО) отдавать предпочтение ПГД или тесту Панораму? Ведь логичнее провести ПГД.
При ПГД исследуется несколько клеток трофэктодермы, которые могут не соответствовать генотипу самого плода. Эти два исследования не заменяют друг друга, а позволяют последовательно снижать риски на каждом этапе.
Стоимость теста и доступность для регионов?
Стоимость теста в последнее время постоянно снижается, поэтому необходимо уточнять актуальную цену на момент исследования в лаборатории. Стоимость анализа при двуплодной беременности не отличается от таковой при одноплодной. Тест доступен в любом регионе – предварительно по экспресс-почте заказывается набор пробирок для забора крови, в которых образцы хранятся долго и спокойно могут быть транспортированы в лабораторию.
Доступен ли тест на бюджетной основе?
В ряде стран такая практика существует, в России пока это платный тест.
Тест Панорама при двуплодной беременности помогает определить риски развития ФФТС?
Да.
Является ли тест на отцовство при беременности достаточно точным?
Да. Используемые технологии (SNP) являются более глубокими и точными, чем стандартные технологии, применяемые на постнатальном этапе.
В лекции указано, что тест может быть рекомендован «почти всем беременным», можно ли его рекомендовать всем?
Существуют семьи с исходно высоким риском (моногенные заболевания, носители транслокаций), им показана индивидуальная программа пренатальных исследований, которая может включать или не включать ДНК-тестирование.
В чем существенные различия между тестами: Panorama, Prenetix, Areosa? В каких случаях стоит назначать тот или иной тест, или тест Panorama на сегодня считается самым лучшим?
Тест Prenetix (название, которое используется в России) раньше выпускался компанией Areosa. На сегодня это тест Harmony компании Le Roshe. Технология тестирования изменялась, сейчас они используют SNP, но только для определения ФФ, но не маркируют сами хромосомы плода. Тест Panorama использует SNP и для оценки числа хромосом , что и дает дополнительные опции.
Были ли ошибки теста?
Существует определенный % перезаборов по тем или иным причинам для получения более достоверного результата. Что касается ложноположительных и ложноотрицательных результатов, то они есть, и это связано с биологической основой – в кровоток матери прежде всего попадает ДНК хориона, которая может не совпадать с плодной ДНК.
Имеет ли смысл сместить первый скрининг на 9 недель, если первое УЗИ рекомендуется в этом сроке?
УЗИ рекомендуется перед ДНК-тестированием для понимания плодности и возможности раннего проведения теста, но в 11-14 недель УЗИ также проводится для оценки пороков развития.
Имеют ли юридическую силу результаты теста с учетом того, что химреагенты не зарегистрированы в России?
Юридическая сторона вопроса по всем высоким технологиям не определена, но это не должно мешать женщине воспользоваться существующими возможностями генетического исследования.
Сроки выполнения теста? Необходимо ли сдавать кровь натощак? Можно ли проводить тест после пересадки костного мозга, переливания эр-массы и плазмы при массивной кровопотере?
Сроки выполнения 7-10 дней, результат отправляется пациентке по электронной почте для ускорения получения ответа. Желательно сдавать тест не сразу после еды и не натощак. В указанных ситуациях ДНК-тест может дать ошибочные результаты, поэтому важно индивидуально оценивать каждую такую пациентку.
До какого срока беременности можно выполнять тест Панорама, если пациентка не выполнила его на ранних сроках?
Какие-либо ограничения отсутствуют. Более того, после 9 недели количество плодной ДНК будет только возрастать и тест будет более показательным.
Данные тест будет недостоверным при мозаицизме плода?
Мозаицизм плода редкая и сложная ситуация, требующая анализа различных тканей плода. Гораздо чаще приходится сталкиваться с плацентарным мозаицизмом. Если это низкопроцентный мозаицизм, велика вероятность, что тест его не выявит. При высоком проценте клеток с анеуплоидиями, они будут выявлены и от лаборатории будет получен ответ о наличии сложностей в проведении тестирования.
Что еще можно будет определять по ДНК плода в ближайшее время?
Ведется много работ в этом направлении. В частности, в компании Natera существует тест Vistara, нацеленный на определение мутаций у плода, способных привести к серьезным моногенным заболеваниям. Возможно, в скором будущем он будет дополнять стандартный пренатальный ДНК-тест.
ДНК-тест является более точным, чем биопсия ворсин хориона?
С учетом того, что биопсия хориона проводится из одной ворсины, а ДНК-оценивает генотип всего хориона, то да. Поскольку клетки, взятые на исследование могут быть мозаичными, а соседние нет, и наоборот.
Увидит ли тест транслокационные формы синдромов (например, транслокационный с. Эдвардса)?
Тест количественный, поэтому будет обнаружен дополнительный генетический материал и в заключении будет указан высокий риск с.Эдвардса.
я прошла тест, а кода подтверждения нет. Почему???
ответить