С момента первого ЭКО, проведенного в России уже родилось огромное количество детей при помощи программ ВРТ. Эта технология продолжает развиваться и использоваться все шире. Каждый год появляются новые исследования, которые совершенствуют программы ВРТ, увеличивая частоту рождения здоровых детей. В этой лекции рассматриваются все современные тренды в эмбриологии, которые повышают эффективность программ ВРТ: предпочтительные методы биопсии, новые культуральные среды, методики ICSI, PICSI и многое другое.
ВЕБИНАР СЛЕДУЮЩИЙ
ВЕБИНАР
Тезисы
Современные технологии в лаборатории ЭКО, их роль в успехе ВРТ
Высоцкий А.Ю.
Клиническая эмбриология – наука о закономерностях развития эмбриона человека, изучающая стадии предзародышевого развития (оогенез, сперматогенез), процесс оплодотворения, развития зародыша, возможные причины нарушений этого развития и также способы моделирования условий для поддержания всех процессов эмбриогенеза in vitro.
Первое ЭКО в России – в 1986 году, и спустя 10 лет – первое ИКСИ в 1996 году.
Основная цель программ ВРТ – достижение высокого уровня «take home baby rate» (рождение здорового ребенка) при переносе одного эмбриона.
Современные эмбриологические технологии
Новые системы культивирования
* Новые линейки сред.
* Новые условия культивирования (low-oxygen, bench top inc).
* Пролонгированное культивирование.
Микроманипуляции
* ICSI, IMSI, PICSI.
* Вспомогательный хетчинг.
* Программы ПГД: биопсия полярного тельца, бластомера, трофэктодермы.
Криоконсервация
* Витрификация яйцеклеток, эмбрионов, ткани яичников.
Time-lapse микроскопия.
ICSI – введение предварительно подготовленного и обездвиженного сперматозоида в цитоплазму яйцеклетки.
PICSI – физиологическая интрацитоплазматическая инъекция сперматозоидов (происходит отбор сперматозоидов по их способности взаимодействовать с оболочкой яйцеклетки (имитация при помощи гиалуроновой кислоты)). Работы многих авторов свидетельствуют о том, что не происходит значимого улучшения показателей при использовании PICSI. Однако, было проведено исследование, которое демонстрирует достоверное снижение количества замираний беременности на ранних сроках при использовании этого метода.
IMSI – интрацитоплазматическая инъекция морфологически нормального сперматозоида (проводится отбор морфологически наиболее качественного сперматозоида по большим увеличением – до х6000). Существуют публикации, свидетельствующие о повышении частоты наступления беременности и уменьшения риска раннего прерывания при использовании данного метода.
Методы получения сперматозоидов
Хирургические: MESA, TESE.
Чрескожные: TESA, PESA.
Электронно-микроскопическое исследование (ЭМИС)
Используется в диагностике бесплодия, оценивает качество хроматина, вирусное инфицирование и перспективы получения сперматозоидов хорошего качества у конкретного пациента.
Новые системы культивирования
Инкубаторы
На смену прежним большим инкубаторам пришли небольшие компактные модели с целым рядом преимуществ: это в основном bench-top инкубаторы, они просты в обращении, занимают малый объем пространства, поддерживают стабильную температуру и стабильные параметры газовой смеси, имеют новые возможности культивирования в среде с низким содержанием О2.
Культуральные среды
* Культивирование с последовательной сменой сред в зависимости от стадии развития эмбриона. Считается более приемлемой, поскольку, развиваясь в организме женщины эмбрион не находится постоянно в одной и той же среде.
* Культивирование в среде, одинаковой для всех стадий развития. Также имеет свои плюсы. В ходе своего развития, эмбрион выделяет биологически активные вещества, которые его окружают и принудительная их смывка при замене сред, может негативно отразиться на качестве эмбрионов.
На сегодня пока отсутствуют убедительные данные о преимуществах тех или иных сред.
Криоконсервация
* Максимальное использование возможностей получения беременности после однократного получения ооцитов в цикле программы ЭКО.
* Проведение переноса эмбриона, не прибегая к повторной стимуляции и пункции фолликулов.
* Уменьшение риска многоплодной беременности.
* Уменьшение риска развития синдрома гиперстимуляции яичников.
* Уменьшение стоимости получения беременности.
* Отсроченный перенос при наличии соматического заболевания у матери на данный момент.
* Гибель эмбрионов в процессе криоконсервации и разморозки в современных условиях – это казуистика.
* Частота наступления беременности выше при криопереносе, поскольку исключаются все негативные факторы, которые могут сопровождать перенос в цикле стимуляции.
Дополнительные возможности
* Создание банка ооцитов (нет необходимости искать и стимулировать донора для конкретной пациентки).
* Моральные и этические проблемы, связанные с криоконсервацией и хранением эмбрионов.
* Запрет на криоконсервацию эмбрионов в ряде стран.
* Возможность сохранить молодые ооциты для более позднего их использования (по желанию пациентки, а не по медицинским показаниям).
* Риск потери овариальный функции после радио- или химиотерапии (у пациентов со злокачественными заболеваниями – программа «Онкофертильность»).
Витрификация – это метод криоконсервации биоматериала, основанный на переходе жидкости при сверхбыстром понижении температуры в стеклообразное состояние, минуя фазу кристаллообразования. При классическом медленном замораживании, именно образование кристаллов губительно для клетки и приводит к ее разрушению.
Особенности витрификации
* Безопасность для биоматериала (пропитан криопротекторами), высокий процент выживания клеток и тканей.
* Отсутствие необходимости дополнительного оборудования.
* Малые временные затраты на проведение процедур замораживания и размораживания (10-15 минут на витрификацию, 10 минут на разморозку).
* Высокая стоимость методики относительно медленной криоконсервации.
Принцип витрификации овариальной ткани аналогичен таковому при витрификации ооцитов или эибрионов.
Новые подходы к селекции наиболее перспективного клеточного материала – Time-lapse микроскопия (покадровая съемка)
Это динамическое наблюдение за развитием эмбриона, исключение проблем статического наблюдения – неправильная трактовка характера дробления, фрагментации, многоядерности и т.д.
Возможность адекватной селекции наиболее перспективного клеточного материала на основе морфокинетических параметров.
На сегодня существуют контраверсии и не везде этот метод используется.
Морфокинетика развития эмбриона
Оценивается временной интервал между стадиями дробления, характер дробления, время формирования всех стадий.
Прогностическая ценность морфокинетической оценки развития эмбрионов признается не всеми, однако существуют статистически значимые данные о том, что этот параметр является важным в выборе перспективного эмбриона.
Новые методики преимплантационной генетической диагностики
Предпосылки для проведения ПГД
* 0,5% новорожденных имеют хромосомные аномалии.
* Хромосомные аномалии являются одной из наиболее частых причин прерывания беременности, врождённых дефектов развития и умственной отсталости.
* Анеуплоидии определяются у 0,3% новорождённых, 25% спонтанных абортов и 50-60% спонтанных абортов первого триместра.
Показания к проведению ПГД
* Поздний репродуктивный возраст и желание повысить вероятность достижения беременности.
*Повторяющиеся неудачные попытки ЭКО.
* Привычное невынашивание беременности невыясненной этиологии.
* Моногенные заболевания.
* Транслокации.
* Резус-конфликт.
* Выбор пола по медицинским показаниям.
Методы биопсии (получение материала для исследования)
* Биопсия полярного тельца (0 или 1 день).
* Биопсия бластомера (3-й день).
* Биопсия клеток трофэктодермы (5-6-й дни). Сегодня постепенно отходят от биопсии 3-го дня, отдавая предпочтение получению клеток трофэктодермы.
Преимущества биопсии на стадии бластоцисты (трофэктодермы)
* Более своевременная диагностика ХА, «генетически стабильное» состояние эмбриона (корректируются до 20% аномалий, диагностированных в полярном тельце и на 3-и сутки развития).
* Снижение риска некорректного диагноза в следствие мозаицизма клеток эмбриона.
* Уменьшение количества случаев эмбриона «без сигнала».
* Малотравматичная методика получения генетического материала.
* Наиболее полная и достоверная информация о генетическом статусе эмбриона.
* Необходим гибкий подход в каждом конкретном случае, зависящий от стадии развития бластоцисты, локализации внутриклеточной массы, особенностей доступа к клеткам трофэктодермы.
Секвенирование нового поколения – NGS
Это техника определения нуклеотидной последовательности первичной структуры ДНК. Технология секвенирования нового поколения позволяет прочитать единовременно сразу несколько участков генома, возможна детекция всех хромосом.
Это прямой, а не косвенный метод.
Наиболее перспективный подход в настоящее время
* Трофэктодермальная биопсия эмбриона.
* Криоконсервация эмбрионов.
* Генетическое исследование биоптатов.
* Перенос здорового эмбриона.
Вопросы
Существует ли статистика по эффективности переноса эмбрионов с ПГД по сравнению обычными переносами?
Каждая клиника ведет свою статистику. В нашей лаборатории эффективность переноса без ПГД – 55-56%, в криопротоколе с ПГД NGS – 66%.
Рекомендуете ли Вы использовать односутпенчатые среды для культивирования?
Исходя из опыта нашей лаборатории, я таких рекомендаций дать не могу (нет опыта), но данные литературы свидетельствуют о том, что эффективность при использовании много- и одноступенчатых сред сопоставима.
Как происходит биопсия криоконсервированного эмбриона? Существуют ли какие-то особенности? Эмбрион замораживается повторно и отражается ли это на его качестве?
Существенные отличия отсутствуют за исключением техники – если эмбрион был заморожен на стадии В1-В2, то следует дождаться стадии В3-В4, чтобы сформировалось достаточное количество клеток трофэктодермы. Эмбрионы замораживаются повторно, негативное влияние присутствует, но оно не фатально. Экспериментально ооцит выживает после 27 циклов витрификации и разморозки.
На какой базе можно получить специализацию по эмбриологии и продолжительность специализации по времени?
Специальности эмбриолога официально не существует. Обучение клеточным технологиям проводится на рабочем месте. Курсы по эмбриологии проводятся на базе института им. Отто в Санкт-Петербурге, в Москве в центре охраны матери и ребенка на Опарина. Существуют тренинги и целевые семинары по узкой специализации, которые организуются ведущими лабораториями или компаниями.
Какова судьба эмбрионов, отбракованных на этапе ПГД?
Это зависит от юридических аспектов, предварительно оформленного договора. Если данный пункт не был отмечен в договоре, эмбрионы остаются витрифицированными еще некоторое время, поскольку те из них, которые обладают низким уровнем мозаицизма могут быть также перенесены, если беременность не наступит или не будет развиваться.
Стоимость витрификации ткани яичника на длительное время, например, при онкозаболеваниях?
Мы проводим эту процедуру бесплатно в рамках совместной деятельности с онкологами. Это пока не коммерческая программа.
С какой частотой вы используете перенос единственного эмбриона в программах ПГД?
В 97-98% случаев мы используем перенос одного эмбриона, тем более в программах ПГД, которые и дают возможность переносить один эмбрион, не повышая рисков.
Проводите ли вы витрификацию на 6 сутки? При наличии двух эмбрионов: 4АА и 4ВС, были бы заморожены оба эмбриона?
Мы проводим витрификацию на 5-6 и даже 7-е сутки. Важное условие – жизнеспособный эмбрион – наличие делящихся клеток. И даже эмбрионы класса С, при наличии клеточной массы имеют потенциал имплантации – 15%, поэтому мы замораживаем все эмбрионы.
Стоит ли биопсировать эмбрионы с трофэктодермой класса С?
У нас было несколько таких пациенток, о результатах пока говорить сложно. Технически это возможно, но существует риск полностью лишить эмбрион трофэктодермы и его возможности к имплантации. Можно после биопсии еще некоторое время культивировать эмбрион, наращивая клеточную массу и уже затем витрифицировать.
Коллеги, лекция не подавалась на аккредитацию. По данной причине она не может быть засчитана
ответить