НИПТ: теоретические и практические аспекты

НИПТ: теоретические и практические аспекты

Ветрова Н.В.

НИПТ — анализ свободно-циркулирующей ДНК-плода

Представляет собой исследование веществ плодного происхождения, присутствующих в крови беременной женщины: ДНК, РНК и белки. Наибольшую практическую ценность представляет анализ свободно-циркулирующей ДНК плода.

Фетальная ДНК/ фетальная фракция

* В 1997 г. было установлено, что во время беременности детектируется в крови женщины.

* Циркулирует в кровотоке матери с 4-ой недели беременности, а после родов элиминируется в течение 2-3-х часов.

* Медленно увеличивается на протяжении всей беременности, в среднем составляя 10% (7.8-13%) от всей свободно-циркулирующей ДНК.

* Представлена небольшими фрагментами (в среднем — 146 пар нуклеотидов).

НИПТ: в системе пренатальной диагностики

* НеИнвазивное Пренатальное Тестирование — Скрининг. Поэтому имеет все скрининговые характеристики: специфичность, чувствительность, ложноположительные и ложноотрицательные результаты.

* НИПТ обладает высокой чувствительностью и специфичностью по оценке риска в отношении наиболее частых анеуплоидий: трисомии 21 (с-м Дауна),18 (с-м Эдвардса) и 13 (с-м Патау).

*Источник фетальной ДНК (фДНК) — апоптотические клетки трофобласта. В случаях плацентарного мозаицизма, цитотрофобласт может содержать аномальную клеточную линию, отсутствующую у плода.

* Высокий риск по НИПТ требует подтверждения диагностическими инвазивными методами: биопсия ворсин хориона/амниоцентез. Чаще применяется амниоцентез как более точный в определении кариотипа плода. Но несмотря на то, что биопсия ворсин хориона анализирует и клетки цитотрофобласта, этот метод остается диагностическим и продолжает использоваться.

Мета-анализ (февраль 2017 г.)

Проанализированы результаты 35 исследований (2011-2016 гг.), посвященных изучению свободно-циркулирующей ДНК плода для скрининга основных анеуплоидий с верификацией диагноза с помощью кариотипирования плода, абортивного материала или новорожденного.

Результаты

* Трисомия 21 (с-м Дауна): частота обнаружения — 99.7%, ложноположительные результаты (ЛПР) — 0.04%.

* Трисомия 18 (с-м Эдвардса): частота обнаружения — 97.9%, ЛПР — 0.04%.

* Трисомия 13 (с-м Патау): (с-м Эдвардса): частота обнаружения — 99.0%, ЛПР — 0.04%.

* Трисомия 21 при двойне: частота обнаружения — 100%, ЛПР — 0.0%.

Сравнительная оценка традиционного пренатального скрининга и НИПТ для выявления трисомии по 21 хромосоме (2015г.)

N=15841 беременных.

Традиционное обследование (биохимия, УЗИ, цитогенетика) — комбинированный скрининг

* В группе высокого риска оказались 884 женщины. После проведенного цитогенетического обследования, лишь у 30 плодов подтвердилась трисомия по 21 хромосоме, в 854 случаях — ЛПР.

* В группу низкого риска попали 14954 женщины, из них у 8 человек был плод с с-мом Дауна.

НИПТ

* Группа высокого риска — 47 человек. После проведенного цитогенетического обследования, с-м Дауна подтвержден у 39 плодов, в 9 случаях — ЛПР.

* Группа низкого риска — 15749 человек. При постнатальном осмотре, ни у одного ребенка не выявлено трисомии 21.

Вывод: Комбинированный пренатальный скрининг формирует большую группу высокого риска по синдрому Дауна. Тогда как НИПТ создает менее узкую группу высокого риска, позволяя увеличить точность диагностики и уменьшить количество проводимых инвазивных исследований. НИПТ не исключает ЛПР, но % таких ошибок крайне низок.

Клинические рекомендации по применению НИПТ в настоящее время

Тест используется на стыке двух специальностей, поэтому может быть назначен акушером-гинекологом без привлечения генетиков.

Мировые профессиональные сообщества (ACOG, ACMG, ESHG) в 2015-2017 гг. разработали и выпустили рекомендации по применению НИПТ в клинической практике.

Модели внедрения НИПТ в систему здравоохранения

Популяционный скрининг (low-risk or population screening)

Проведение НИПТ всем беременным вместо пренатального комбинированного теста в качестве первой линии.

Контингентный скрининг (high-risk or contingency screening)

Проведение НИПТ беременным из групп высокого и/или среднего риска, выделенным по результатам пренатального комбинированного скрининга (ПКС).

Контингентный скрининг

На настоящий момент внедряется в большинстве стран мира.

Скрининг 1 триместра в сроке 11-13 недель гестации и 6 дней

* УЗИ с измерением ТПВ, оценкой носовой кости и допплерометрией венозного протока;

* определение материнских сывороточных маркеров (РАРР-А и b-ХГЧ);

* расчет индивидуального риска рождения ребенка с хромосомной патологией с помощью компьютерной программы, основываясь на базовом возрастном риске.

Формирование границ групп риска

Границы групп риска биологически обусловлены в зависимости от средних значений по частоте выявляемости конкретной патологии в определенной группе женщин.

Каждая страна формирует свои границы риска, основываясь на биологических особенностях и экономических возможностях государства для введения НИПТ в свою систему здравоохранения.

В РФ группа с высоким риском ≥ 1:100 — всем женщинам рекомендуется диагностическое обследование.

Тактика по результатам традиционного скрининга:

* высокий риск (≥1:10-100) — инвазивная диагностика (выявляет 70-85% плодов с с-мом Дауна);

* средний/промежуточный риск (1:10-100-1: 500-1000) — в разных странах внедряется модель применения НИПТ именно в этой группе;

* низкий риск (<1:500-1000) — УЗИ на сроке 18-22 недели.

Рекомендации мировых сообществ по модели применения НИПТ

* ISPD — возможно использование в качестве основного скринигового теста для всех беременных.

* ESHG — в качестве первой линии пренатального скрининга.

* ACOG — предлагать всем женщинам, но, тем не менее, стандартные методы являются подходящим выбором для большинства женщин.

* ACMG — информирование пациентов, что НИПТ является наиболее чувствительным вариантом пренатального скрининга трисомии 21,18 и 13.

Фармакоэкономические исследования

Использование НИПТ в качестве тестирования первой линии в рамках скрининга трисомии 21 может быть более выгодным по сравнению с традиционным текущим скринингом, поскольку позволяет увеличить частоту обнаружения синдрома Дауна и уменьшить количество выкидышей после инвазивных процедур. Обе модели — и популяционного, и контингентного скрининга с применением НИПТ — показывают лучшие результаты по сравнению с комбинированным скринингом, но стоимость их выше, что является препятствием на пути внедрения.

Ограничения по внедрению НИПТ в популяционный скрининг в качестве первой линии

1. Неполучение результатов: в 1-2% случаев требуется перезабор.

2. Неинформативные результаты при беременностях более чем 2-мя плодами (результаты исследований не валидированы и НИПТ не может использоваться в этих группах).

3. Неинформативные результаты при несостоявшейся двойне. Плацента замершего плода какое-то время продолжает функционировать (длительность определить невозможно), поэтому клетки трофобласта могут стать источником определенной доли фДНК: в крови беременной женщины присутствуют ДНК обоих плодов. Возможно получение ЛПР, что не позволяет правильно оценить ситуацию и приводит к неоправданным инвазивным вмешательствам. Тест используется с осторожностью, а женщина информируется о вероятности ЛПР.

4. Неинформативные результаты у женщин-носительниц хромосомных сбалансированных перестроек, с мозаичным кариотипом, со злокачественными новообразованиями, после трансплантации органов или переливания крови. Это связано с присутствием дополнительного генетического набора — ДНК другого происхождения, который можно принять за ДКН плода и неправильно интерпретировать результаты.

Факторы, влияющие на уровень фетальной фракции (ФФ) ДНК

Достоверность НИПТ снижается при низкой ФФ — менее 4%. Поэтому получение таких результатов, требует перезабора.

По данным исследования (2013г, n=22.384) около 2% беременных женщин имели низкий уровень ФФ, что ограничивало достоверную оценку риска анеуплоидий.

Предполагаемые факторы

1. Срок гестации:

На общепопуляционном уровне, ФФ увеличивается со сроком беременности, однако индивидуальный уровень ФФ непредсказуем, поэтому получение низких цифр, требует перезабора крови.

2. Вес беременной: высокий вес коррелирует с низким уровнем ФФ.

3. ЭКО: ассоциировано с низким уровнем ФФ.

4. Этническая принадлежность беременной: принадлежность к популяции Южной и восточной Азии коррелирует с более низким уровнем ФФ.

Причины расхождения результатов

До 10% всех случаев высоких рисков по НИПТ не соответствует кариотипу плода/новорожденного (ЛПР). Более чем в 50% случаев биологические причины подобных расхождений могут быть установлены.

Основные биологические причины расхождения результатов НИПТ

1. Мозаицизм — присутствие клеток с разным кариотипом в одном организме:

* плацентарный: когда у матери и плода присутствует один кариотип, а в плаценте находится отличающийся от них аномальный кариотип;

* материнский: в крови женщины присутствуют клетки с аномальным хромосомным пулом — наиболее часто анеуплоидии по половым хромосомам (лишняя/отсутствующая Х-хромосома);

* плодный: различные формы мозаичных хромосомных аномалий (с-м Дауна, с-м Эдвардса и др.).

2. Злокачественные новообразования у матери:

* в крови присутствует аномальная онкологическая ДНК;

* доля ФФ может значительно уменьшаться из-за увеличенного количества внеклеточной ДНК онкологического происхождения.

3. Несостоявшаяся двойня.

4. Химеризм — вследствие трансплантации органов у матери в анамнезе или переливания крови.

N.B. Результаты НИПТ не должны рассматриваться в отрыве от результатов других клинических тестов!

Маркеры хромосомных аномалий на УЗИ

Наличие маркеров ХА или ВПР — показание для инвазивной диагностики и проведения хромосомного микроматричного анализа (ХМА).

НИПТ не должен быть рекомендован для генетической оценки этиологии аномалий, диагностируемых при УЗИ, поскольку частота обнаружения, чувствительность и негативное предиктивное значение ниже, чем когда речь идет о кариотипировании, либо ХМА.

Методы анализа внДНК

Массовое параллельное секвенирование (MPSS)

Позволяет анализировать участки всех хромосом, циркулирующих в крови беременной женщины. Далее при помощи биоинформатического анализа учитывается и оценивается количество 21,18 и 13 хромосом.

Направленный (таргетный) анализ

Предполагает направленное и избирательное исследование интересующих участков хромосом. В последующем применяются специализированные программы, оценивающие риск.

N.B. Исследователи не обнаружили различий в показателях чувствительности и специфичности для обоих методов.

Клинические исследования НИПТ Пренетикс (Harmony)

Исследовалось ˃218 000 образцов, включенных в рецензируемые публикации.

Рекомендации по включению патологий в пренатальный скрининг с помощью НИПТ:

* трисомии 21 (синдром Дауна);

* трисомии 18 (синдром Патау);

* трисомии 13 (синдром Патау).

Варианты расширения списка скринируемых заболеваний за счет:

* анеуплоидий по половым хромосомам;

* анеуплоидий по «редким» аутосомам (кроме, 13,18,21);

* микроделеционных и микродупликационных синдромов;

* моногенных заболеваний.

Пока не внедрено в широкую клиническую практику увеличение списка заболеваний. Расширенный вариант используется лишь некоторыми коммерческими компаниями.

Хромосомные аномалии (ХА) — одна из самых частых причин самопроизвольных выкидышей и младенческой смертности

Рекомендовано проводить анализ 13,18 и 21 хромосом, поскольку именно эти ХА наиболее часто встречаются при живорождении. Аномалии по другим хромосомам, как правило, не совместимы с жизнью и беременность самостоятельно прерывается на ранних сроках, поэтому нет необходимости в расширении скрининга по другим аутосомам.

Исходы беременностей при ХА:

* выкидыши до 12 недель — 60% (часто не диагностируются);

* выкидыши в 12-20 недель — 20%;

* живорождение — 5%.

НИПТ с анализом редких аутосомных трисомий (RATs)

Недостатки

* RATs летальны, поэтому беременность чаще всего прерывается на ранних сроках.

* Низкая положительная прогностическая ценность результата (PPV).

* Аномалии могут присутствовать в плаценте (плацентарный мозаицизм), клетки которой быстро делятся, поэтому выше % ошибок. Соответственно в плаценте потенциально возможно наличие мозаичных форм анеуплоидий, связанных с аномалиями по другим аутосомам (за исключением 13, 18 и 21 хромосом).

* Обычно не ассоциированы с аномалиями при УЗИ и осложнениями беременности.

* Ни один метод инвазивной диагностики не позволяет полностью исключить плодный мозаицизм (вопрос подтверждающей диагностики).

Преимущества

Явление может быть ассоциировано с синдромом задержки развития плода (СЗРП), что позволяет своевременно начать лечение.

Однако присутствие мозаичного пула не всегда связанно с наличием аномалий. Кроме того, НИПТ валидирован на регулярные формы трисомий, тогда как уровень мозаицизма при RATs\СЗРП неизвестен.

Анализ внДНК на все хромосомы после переноса эмбриона с мозаичной формой анеуплоидий

(PGDIS, 2019 г.)

Для ранней оценки хромосомного набора клеток плаценты (с 10 недель), может быть предложен НИПТ, анализирующий количество всех копий ДНК. Стандартный тест на 5 хромосом в данном случае не показан, поскольку изначально не рекомендован перенос эмбриона с мозаичными формами по 13,18 и 12 хромосоме.

Материал для исследования:

* ДНК из клетки трофэктодермы при ПГТ-А (предимплантационном генетическом тестировании/анализе);

* ДНК из клетки трофэктодермы при НИПТ.

Анализируемая ДНК:

* WGA из единичных клеток при ПГТ-А;

* короткие фрагменты внДНК при НИПТ.

НИПТ позволяет выявлять мозаичные формы ХА, но не валидирован для этих целей (уровень мозаицизма, позволяющий детектировать НИПТ, неизвестен).

Таким образом, результаты ПГТ-А и НИПТ не позволяют выявить истинно плодный мозаицизм и, соответственно, дифференцировать его от мозаицизма, ограниченного плацентой. Истинный фетальный кариотип можно получить только при проведении амниоцентеза — рекомендуется при переносе мозаичного эмбриона.

НИПТ с исследованием половых хромосом (ПХ)

ХА пока не включены в скрининг, поскольку редко встречаются и, скорее всего, ограниченны плацентой.

Поведены мета-анализы

Исследования валидированы, дают высокий % чувствительности и специфичности.

Результаты:

* трисомия Х (синдром Тернера): частота обнаружения (ЧО) — 95.8%, ЛПР — 0,14%;

* другие хромосомные аномалии: ЧО — 100-95%, ЛПР — 0.004%.

Ограничения для расширения скрининга за счет исследования ПХ

* Вариабельный фенотип и сложность его прогнозирования. Так, например, трисомии Х (ХХХ) или дисомии Y (ХYY) не всегда сопровождаются тяжелой ВПР и тяжелыми формами умственной отсталости.

* Высокий процент ЛПР, особенно при синдроме Тернера, поэтому возможно проведение необоснованных инвазивных вмешательств.

* При подтверждении ХА, невозможно определить фенотип.

На практике вопрос решается индивидуально: с женщиной обсуждается необходимость инвазивной диагностики и прерывания беременности.

Клинические рекомендации в отношении исследований анеуплоидий по половым хромосомам

* ISPD — у пациентов должна быть возможность выбора включения данных синдромов в исследование.

* ESHG — в настоящее время не рекомендуется.

* ACOG — возможно по запросу пациента.

* ACMG — пациенты должны быть проинформированы о доступности тестирования, включая ограничения.

Рекомендации ACMG в отношении анализа внДНК с исследованием ПХ

* Информировать всех беременных о возможности использования НИПТ.

* Избегать исследования половых хромосом, в случае преследования единственной цели потенциального выбора плода по полу, при отсутствии клинических показаний.

* Информировать пациентов до проведения скрининга о значительной доле ЛОР и подтверждать высокие риски инвазивной диагностикой.

* Предоставлять родителям полную и актуальную информацию о заболевании и его проявлениях в случае диагностированной анеуплоидии по половым хромосомам, чтобы семья могла принять самостоятельное решение о пролонгировании беременности. Для оказания информационной помощи в этом вопросе, общество по редким заболеваниям выпустило брошюру (переведена на русский язык), где приведены данные по фенотипическим особенностям этих детей, образе жизни и т.д. Это позволяет будущим родителям подробно ознакомиться с заболеванием, диагностированным у плода и принять решение.

НИПТ с анализом микроделеционных синдромов (МДС)

Микроделеция — это качественная, а не количественная хромосомная патология, связанная с перестройкой отдельных участков хромосом разных размеров. Существуют известные и повторяющиеся МДС с характерными клиническими проявлениями.

Недостатки

* Фенотип крайне вариабелен, поэтому клинические проявления зависят от размера выпадаемого участка и генов, вовлеченных в перестройку. Поэтому нередко приходится сталкиваться со сложностями в интерпретации результата и прогнозировании фенотипа.

* Высокий % ЛПР.

Оценка PPV — положительной прогностической значимости результата

* При синдроме Дауна PPV очень высока и значительно снижается при анализе МДС.

* Если риск по анеуплоидиям основных хромосом увеличивается с возрастом, при МДС риск стандартен для всех женщин любого возраста.

* Частота встречаемости МДС невысока.

PPV на примере с-ма Ди Джоржи — «кошачьего крика»

* N=500 000, из них 1 случай — с высоким риском, 49 999 — с низким.

Результаты:

* 126 ЛПР, из них 1 случай — истинно положительный результат (PPV˂ 1%);

* 125 — неоправданных инвазивных вмешательств.

Полученные показатели ограничивают включение НИПТ для скрининга МДС.

НИПТ с анализом микроделеции 22q11.2 — с-ма Ди Джоржи

* По данным разных авторов частота встречаемости варьирует от 1:2000 до 1:4000

* Второй по частоте встречаемости и среди причин развития пороков сердца после с-ма Дауна, что является обоснованием для включения скрининг НИПТ.

Характерные признаки:

* ВПС — тетрада Фало;

* когнитивный дефицит;

* гипокальциемия;

* гипоплазия тимуса;

* расщелина неба.

Однако размеры делеций могут варьировать в одном и том же регионе (разный тип, размер и количество вовлеченных генов), обуславливая вариабельный фенотип.

Исследование с проведением таргетного анализа

Показало высокую частоту ЛПР и низкую чувствительность для оценки микроделеций, поэтому метод не применяется.

Клинические рекомендации в отношении МДС

Мировые медицинские сообщества пока не рекомендуют расширение НИПТ за счет включения МДС.

НИПТ с анализом моногенных мутаций

Преимущества

НИПТ позволяет детектировать варианты последовательностей ДНК, унаследованных плодом от отца — например, фрагменты Y-хромосомы гена RHD (чувствительность ˃99%) или мутации аутосомно-доминантных заболеваний — унаследованных или de novo.

Недостатки:

* состояния встречаются крайне редко, что затрудняет валидацию;

* специфичность и чувствительность не исследована;

* при Х-сцепленных и аутосомно-рецессивных заболеваниях, присутствие материнского патологического аллеля затрудняет интерпретацию.

N.B. Результаты НИПТ необходимо подтверждать инвазивными методами.

Ограничения расширенного скрининга с применением НИПТ

1. Анеуплоидии по половым хромосомам — вариабельный фенотип и высокий процент ЛПР при моносомии Х (с-м Тернера).

2. Микроделеционные синдромы — высокий процент ЛПР, низкая прогностическая ценность результата и вариабельный фенотип.

3. Редкие аутосомные трисомии RATs (кроме 13,18 и 21) — сложности интерпретации, низкая прогностическая ценность результата в клинической практике

4. Моногенные заболевания — перспективное направление. Однако отсутствуют валидационные исследования ввиду редкости нозологии, что ограничивает применение НИПТ при Х-сцепленных и аутосомно-рецессивных заболеваниях у матери.

Ожидаемые проблемы в связи с введением расширенного скрининга

* Снижение клинической ценности и вероятности выявления патологии.

* Повышение проблем с интерпретацией результатов.

Предтестовая консультация

Обсуждение вопросов с беременной женщиной

* Метода исследования: скриниговый или диагностический.

* Возможность неполучения результата или неинформативного результата при наличии ограничений: вес, «исчезающий» близнец, онкологические заболевания, трансплантация органов/переливание крови, ˃2-х плодов.

* Возможность расширения скринируемой патологии и связанных с этим рисков и ограничений (высокий процент ЛПР, вариабельный фенотип).

* Вероятность получения информации о возможных аномалиях/особенностей кариотипа самой обследуемой.

Вопросы

НИПТ включен в Клинические Рекомендации (КР)?

Нет. Приказ МЗ РФ №572н, регламентирует проведение комбинированного скрининга с последующей инвазивной диагностикой при получении высокого риска.

Касательно применения НИПТ, в 2016 г. институтом акушерства и гинекологии им. В.И. Кулакова были выпущены единственные КР, которыми можно руководствоваться. НИПТ платный и пока не включен в систему ОМС. Женщина информируется о возможности проведения теста, в случае его выполнения, обязательно оформляется письменное информированное согласие.

Традиционный пренатальный тест выявил высокий риск трисомии по 21 хромосоме при нормальных УЗ-маркерах. Дважды уровень ФФ был недостаточным, поэтому НИПТ не был проведен. Можно ли подозревать наличие ХА в данном случае?

Данные противоречивы. Ранее считалось, что низкий % ФФ ассоциирован с ХА у плода. На сегодня известно, что уровень ФФ при с-ме Дауна может даже превышать средние значения, а низкие показатели ФФ связывают с с-ми Эдвардса и Патау. Имеется опыт разных мировых лабораторий, указывающий, что перезабор крови по причине низкого уровня ФФ позволяет получить достоверные результаты исследования, не повышая рисков. В данном случае рекомендуется проведение инвазивных методов диагностики.

Многие лаборатории предлагают диагностику моногенных заболеваний при помощи НИПТ, но данные КИ указывают на недостаточную информативность результатов. Чем лаборатории обосновывают проведение НИПТ?

Обосновывают тем, что женщина получит больше информации. Диагностика моногенных заболеваний — это перспективное направление, однако валидационных исследований, подтверждающих высокую чувствительность и специфичность теста, пока проведено не было. Поэтому тест может быть использован в клинической практике, но всю ответственность несет доктор, назначивший НИПТ.

На 2-ом скрининге выявлен высокий риск дефекта нервной трубки, но в другой лаборатории показатели в норме. По УЗИ — норма. Может ли НИПТ исключить эту аномалию?

Скрининг 2-го триместра сейчас не применяется в связи с низкой информативностью и высоким % ЛПР биохимического скрининга (гораздо выше, чем при скрининге 1-го триместра). Скорее всего, в данном случае высокий риск обусловлен повышенным уровнем α-фетопротеина. НИПТ анализирует ХА. Если на УЗИ дефекта нервной трубки не выявлено, можно исключить высокий риск по данной патологии.