Клиническое применение Неинвазивного Пренатального Тестирования для исключения хромосомной патологии плода

Кречмар М.В.

История неинвазивного пренатального тестирования (НИПТ)

• Первые упоминания о наличии неких плодных структур в крови матери, датируются еще 1947 годом, когда не было открыто ДНК.
• В конце 80-х годов появилась возможность определения гена SRY и резус-фактор плода.
• Начало 21 века – выявление анеуплоидий плода по свободной ДНК в крови матери.
• С 2011 года – введение в мировую клиническую практику НИПТ для исключения анеуплоидий.
• С 2013 года – детекция микроделеционных синдромов плода.
• На пороге клинической практики – тестирование моногенных синдромов по ДНК плода в крови матери.

Исследования внеклеточной ДНК плода в крови матери

Возможности применения в клинической практике на сегодняшний день.

• Определение количества материала ДНК хромосом 21, 13, 18, Х и У и расчет для оценки вероятности синдромов Дауна, Патау, Эдвардса, Тернера, ХХУ, ХУУ, ХХХ и триплоидий.
• Определение микроделеций Ди Джоржи, 1р36, 5р-, Ангельмана, Прадера-Вилли.

НИПТ обладает высокой точностью – более 99% и может быть рекомендован почти всем беременным.

Разные лаборатории – разный подход к диагностике

Важно понимать различия в том или ином методе НИПТ. От этого напрямую зависит точность и возможности тестирования.

Существуют 2 метода

• Массивное параллельное секвенирование. Наиболее распространенный метод, является количественным, и не способен различить материнскую и плодовую ДНК. Основан только на исключении лишнего материала отдельных хромосом. Дает ложные результаты при замершей беременности или наличии у матери аномалии по половым хромосомам. Прогностическая значимость метода низка и составляет 40-45%.
• Оценка однонуклеотидных полиморфизмов (SNP). Метод способен четко разделить плодовую и материнскую ДНК и вести анализ строго по плодовой ДНК. Основан на определении нуклеотидных последовательностей в цепи ДНК, которые уникальны для каждого человека, тем самым точно определяя ДНК плода. Специфичность и чувствительность метода очень высока, достигая 100%.

Преимущества НИПТ, основанного на SNP

• Определение фетальной фракции (количество плодной внеклеточной ДНК (вкДНК) к вкДНК матери).
• Разделение генетической информации плода и матери.
• Идентификация ДНК второго замершего плода.
• Генетический пол плода.
• Триплоидия.
• Микроделеции.

Благодаря этим пунктам можно получить меньшее число ложноположительных и ложноотрицательных результатов.

Патологии, выявляемые НИПТ, основанного на SNP и неопределяемые количественным НИПТ

• Мозаицизм матери.
• Замерший второй плод.
• Триплоидии.
• Пол плода.
• Делеция 22 q\Ди Джорджи. На УЗИ иногда выявляют пороки сердца. В 93% случаев отсутствует семейный анамнез. Встречается гораздо чаще хромосомных синдромов, по частоте находится на втором месте после с.Дауна. Синдром может быть случайностью или наследоваться от матери. Проявления синдрома могут быть как самыми минимальными, так и очень выраженными. Клинические признаки: врожденный порок сердца (75%), иммунодефицит (75%), аномалии неба (70%), шизофрения в молодом возрасте (25%), гипокальциемия (77%), задержка психомоторного развития (70-90%). Помощь на ранних этапах: планирование родов в специализированном перинатальном центре, соблюдение осторожности при введении живых вакцин, контроль уровня кальция для профилактики гипокальцемических судорог, исключение расщелину неба.
• Делеция 1р36, синдром Ангельмана, с. Прадера-Вилли, с. кошачьего крика. В большинстве случаев аномалии при УЗИ не выявляются, невозможно спрогнозировать, поскольку появляются в семьях, где раньше таких случаев не было.

С возрастом у женщины количество клеток с утерянной Х-хромосомой увеличивается, и составляет порядка 6%. Количественный метод не может определить мозаицизма матери и 8,56% ложноположительных результатов связаны именно с этой патологией. SNP способен определить мозаицизм матери.

Многие беременности стартуют как многоплодные, но один из плодов замирает на ранних сроках, зачастую имея хромосомную аномалию. Его вкДНК сохраняется в крови матери еще 6 недель после гибели, и при использовании количественного метода оценивается именно ДНК замершего плода, что обуславливает 1\3 всех ложноположительных результатов. SNP способен разграничивать ДНК замершего и живого плода.

Триплоидии способен выявить только НИПТ SNP, разграничивая при этом отцовскую или материнскую. Чаще всего при триплоидии происходит выкидыш на ранних сроках, но описаны случаи сохранения и во 2 триместре.

Триплоидия отцовского происхождения создает риск молярной беременности (риск трофобластической болезни, злокачественных опухолей).

Материнская триплоидия может повторяться.

При определении пола плода количественным НИПТ часто получаем несоответствие или не получаем ответа вовсе. При НИПТ SNP отклонения имеют нулевое значение. Ошибки в определении пола имеют свои последствия, поскольку на УЗИ определяется фенотипический пол, а не генетический, и при расхождении результатов, требуется медико-генетическое консультирование.

Микроделеции

Микроделеции – это утеря части ДНК. Клинические проявления будут зависеть от размера участка и значимости задействованных генов.

На сегодняшний день НИПТ SNP позволяет исключить 5 микроделеций, показывая высокую положительную прогностическую значимость.

Высокий и низкий риск по результатам НИПТ SNP

Постоянно проводится валидация этого теста, оценка клинических случаев и расчет прогностической значимости, которая остается неизменно высокой.

По результатам теста нельзя поставить диагноз, поскольку ложноположительные или ложноотрицательные результаты все же встречаются. Но можно определить высокий или низкий риск той или иной хромосомной патологии, что позволяет значительно сузить группу риска по пренатальному скринингу.

НИПТ SNP не внесен в программу пренатального скрининга, но в марте 2015 года появились европейские и американские рекомендации по внесению НИПТ SNP в государственную программу пренатального скрининга в тех странах, где он используется.

Алгоритм проведения НИПТ

• Информирование семьи до наступления беременности или на ранних сроках.
• УЗИ в 9 недель (КТР, СБ, плодность).
• Медико-генетическое консультирование, оценка всех видов риска и вероятности хромосомных аномалий.
• Принятие решения родителями (беременной), письменное информированное согласие.
• Забор крови – пересылка – выделение ДНК – секвенирование – биоинформационная обработка – расчет вероятностей – результат исследования.
• Итоговое медико-генетическое консультирование, пересчет рисков по ХА, заключение, рекомендации по дальнейшим этапам пренатальной диагностики.

Анализ собственных данных

Было изучено 250 случаев у женщин от 19 до 47 лет со смещением количества в более старшую возрастную группу.

В большинстве случаев НИПТ SNP показал крайне низкий риск и были рождены здоровые дети. В 2 случаях был определен низкий риск, но во 2-м триместре обнаружились тяжелые ХА несовместимые с жизнью, беременность была прервана. В 3-х случаях были обнаружены корригируемые патологии, беременность сохранена.

13 случаев трисомии 21, четыре из которых получили низкий риск по комбинированному пренатальному скринингу.

В 3-х случаях были обнаружены аномалии по половым хромосомам.

В 2-х случаях при ранней диагностике с.Дауна, до 11-12 недели удалось провести не только НИПТ, но и инвазивнуцю диагностику, подтвердить диагноз и прервать беременность, не подвергая здоровье женщины высокому риску.

Выводы

• НИПТ – высокоинформативный тест для оценки состояния плода, исключения частых анеуплоидий и микроделеций.
• Тест НИПТ должен стать первым шагом в программе пренатальных иследований.
• Применение НИПТ снижает количество инвазивных диагностик и уменьшает ятрогенные потери здоровых плодов.
• При назначении НИПТ всегда проводится пре- и постнатальное медико-генетическое консультирование.

Вопросы

Женщине 38 лет. Беременность первая, спонтанная. По результатам пренатального скрининга риск низкий, но генетики рекомендуют инвазивную диагностику из-за кариотипа отца. Можно ли провести НИПТ пациентке, отказавшейся от инвазивной диагностики? Супругу 41 год. Кариотип 41 XY + МА. Фенотип нормальный. Кариотип определяли из-за бесплодия во втором браке, в первом – имеется дочь – от кариотипа отказалась, с ее слов – здорова.

НИПТ определяет отдельные хромосомные патологии и не направлен на исследование всего генотипа. В данном случае рекомендуется медико-генетическое консультирование семьи и разъяснение рисков, связанных с дополнительной хромосомой, построение индивидуального пренатального скрининга.

Если второй плод замер на 8-9 неделе, его ДНК всегда можно разграничить от ДНК живого плода?

Если используется количественый метод, то нет, ДНК мертвого плода может быть принято за ДНК живого. При использовании метода определения нуклеотидных последовательностей, ДНК замершего плода всегда можно отличить от ДНК живого. После замирания, ДНК погибшего плода циркулируют еще 6 недель.

С какого срока гестации возможно проведение неинвазивного пренатального теста?

Количественный метод недостаточно точен, поэтому его рекомендуют проводить после 11 недели. НИПТ SNP проводится с 9 недели по плоду или по КТР более 25 мм. Предварительно проводится УЗИ и только при наличии сердцебиения и КТР 25 мм и более, набирается кровь на исследование.

Почему международные сообщества не рекомендуют проведение НИПТ на микроделеции?

Я не встречала категоричных рекомендаций, но важно понимать, что НИПТ только недавно начал использоваться в качестве определения риска тех или иных делеций, и он не ставит диагноз, а лишь определяет риск, который впоследствии нужно исключить или подтвердить.

Как долго выполняется тест и есть ли возможность его ускорения?

На данный момент ведутся поиски ускорения проведения тестирования, но важно понимать, что это плановый скрининг, который не должен быть выполнен в спешке. Сейчас мы женщинам указываем срок проведения тестирования – 2 недели, но, как правило, он бывает готов раньше. В любом случае при заборе крови в 9 недель, до 12 недель мы получаем результаты.

Стоимость теста? Планируется ли снижение? Планируется ли его внедрение в систему ОМС?

Как и у любого другого высокотехнологичного метода, стоимость НИПТ не может быть низкой, но с момента его появления, стоимость снижается с каждым годом. Европейские сообщества рекомендуют его внедрение в ОМС, но у нас пока не проводится шагов в эту сторону. Однако, сейчас тестирование доступно любой беременной даже из отдаленных районов. При заказе, женщине отправляется набор для забора крови, которая потом транспортируется в центр. Выезжать в крупные города для этого не нужно.

Можно ли рекомендовать НИПТ всем беременным? Рекомендуете ли Вы проведение НИПТ на ранних сроках еще до проведения комбинированного скрининга или уже после получения его результатов?

НИПТ можно рекомендовать всем беременным за исключением особых семейных ситуаций, где есть те или мутации, носительста. Им рекомендовано индивидуальное пренатальное исследование. Желательно проведение на ранних сроках, чтобы при необходимости была возможность прервать беременность до 12 недель.

Если беременность была прервана по причине трисомии 21, а уже в следующем цикле произошло зачатие, присутствует ли риск трисомии и возможно ли проведение НИПТ?

Такую семью должны проконсультировать генетики, чтобы исключить некоторые особенности. Если зачатие произошло так быстро, ДНК предыдущего плода еще циркулируют в крови матери, но их не так много. Если использовать количественный метод, то есть риск их ошибочно принять за ДНК живого плода. НИПТ SNP четко определяет ДНК живого плода от предыдущего, поэтому тестирование возможно.

Работает ли тест при тройне? Стоимость теста?

Тест пока не работает при тройнях. Стоимость варьирует в зависимости от конкретной ситуации и необходимости исследования на микроделеции.

Работает ли тест при двойне?

При двойнях технически лучше проводить исследование количественным методом, но точной информации по половым хромосомам мы не получим.

На каком оборудовании вы работаете?

Мы не проводим анализ в нашей клинике, а в лучших лабораториях мира, где сконцентрирована нужная высокотехнологичная аппаратура.

Как быть с женщинами, у которых при исследовании оказалось недостаточной плодовая фракция ДНК?

Мы проводим повторный забор крови, но не оставляем такую женщину без внимания, поскольку низкая фракция может свидетельствовать о других патологиях, на которые не ориентирован НИПТ или об акушерских особенностях.

Кто дает направление на тестирование?

Акушер-гинеколог дает направление на медико-генетическое консультирование, генетик на тестирование.