Технологии ВРТ стремительно развиваются в последние годы и с каждым разом удается получить все больше ошеломляющих результатов, которые еще вчера казались невыполнимыми. Из этой конференции вы узнаете какой триггер овуляции является опимальным на сегоднятший день— позволяющий избежать синдрома гиперстимуляции яичников без негативного влияния на лютеиновую фазу; как должна быть оборудована современная лаборатория IVF; что нового в преконцепционном генетическом скрининге и каковы преимущества теста NextGen21. Не менее интересны доклады о пересмотре тактики при мозаицизме и подготовке мужчины к ВРТ — когда, кому и насколько эффективно. В завершение конференции докладчики познакомят с собственным опытом организации лаборатории и биопсии трофэктодермы при больших объемах работы, а также с инновациями в пренатальном генетическом скрининге.
15:30 - 15:35 |
«Приветственное слово» Корнилов Николай Валерьевич, медицинский директор Next Generation Clinic |
15:35 - 16:00 |
«Замена триггера и безопасная клиника ВРТ» Корнеева Ирина Евгеньевна, к.м.н., Доктор медицинских наук. Ведущий научный сотрудник ФГБУ НМИЦ АГиП имени академика В.И. Кулакова |
16:00 - 16:20 |
«Что такое современная технология IVF лаборатории» Левков Лев Алексеевич, к.м.н., директор по науке и развитию Next Generation Clinic, г. Москва |
16:20 - 16:45 |
«Самолет не полетит» или почему NGC такая как есть» Корнилов Николай Валерьевич, медицинский директор Next Generation Clinic |
16:45 - 17:00 |
«Преконцепционный скрининг или будущее обязательно настанет» Васильев Роман Вячеславович, генетик, биоинформатик Next Generation Clinic, г. Санкт-Петербург |
17:00 - 17:15 |
«Преимплантационное тестирование и технические, биологические ограничения. Пересмотр тактики при мозаицизме» Вяткина Светлана Вячеславовна, заведующая лаборатории генетики Next Generation Clinic, г. Санкт-Петербург |
17:15 - 17:30 |
«Мужской фактор бесплодия – нужно ли готовить мужчин к программам ВРТ?» Боголюбов Сергей Владимирович, директор андрологической службы Next Generation Clinic, г. Москва |
17:30 - 17:45 |
«Биопсия трофэктодермы или ничто как опыт» Павлова Марина Николаевна, эмбриолог Next Generation Clinic, г. Санкт-Петербург |
17:45 - 18:00 |
«Пренатальное ДНК-тестирование - инновации 2017» Кречмар Марина Валерьевна, заведующая отделением клинической генетики Next Generation Clinic, г. Санкт-Петербург |
18:00 - 18:30 |
Дискуссия |
ВЕБИНАР СЛЕДУЮЩИЙ
ВЕБИНАР
Тезисы
Выбор триггера овуляции – путь к безопасному ЭКО
Корнеева И.Е.
«Дружественное» ЭКО
Эффективность = роды доношенным плодом в каждом цикле.
Безопасность = неосложненная беременность одним плодом.
Патофизиология
Сосудистый эндотелиальный фактор роста (СЭФР) – физиологические условия (множественные полисерозиты)
* R2 СЭФР: повышение уровня Ca2+ ведет к разрушению плотных межклеточных контактов, повышению проницаемости и отеку;
* R1 СЭФР поддерживает стабильность клеток, препятствует выходу плазмы во внесосудистое пространство.
N.B. При профилактике важно добиться баланса между рецепторами R1 и R2 типа.
Эффективность протоколов с агонистами и антагонистами ГнРГ по данным 45 РКИ (N=7511): частота СГЯ в протоколах с антагонистами ГнРГ статистически значимо ниже, чем в протоколах с а-ГнРГ. Частота беременности/рождения живых детей не различается.
В длинном протоколе замена триггера невозможна, но могут быть использованы другие методы профилактики.
Механизм действия агонистов ГнРГ
* Двухфазность: стимуляция гипоталамо-гипофизарной оси с высвобождением гонадотропинов (в большей степени ЛГ), при длительном применении – блокада.
* Более физиологичное действие, способствующее высвобождению ФСГ и ЛГ.
* Меньшее воздействие на экспрессию СЭФР.
* Снижение объема яичников в середине лютеиновой фазы после введения а-ГнРГ по сравнению с чХГ.
Агонисты ГнРГ в профилактике СГЯ
Единый консенсус по дозировкам пока не достигнут, а в литературе можно встретить разные данные.
Средние рекомендованные дозы:
* Трипторелин 0,2 мг;
* Леупролид ацетат 0,5 – 4 мг;
* Бусерелин 0,5 мг.
Последние данные 2017 года — предикторы тяжелого СГЯ
Ретроспективный анализ (2009-2014 гг.): 5493 циклов ЭКО/ИКСИ, 2982 пациентки.
Результаты:
* тяжелый СГЯ диагностирован в 20 циклах (0,36%, 95% ДИ 0,20-0,52);
* наличие ˃15 промежуточных фолликулов диаметром (Д) ≥ 10 мм в день введения триггера овуляции – лучший предиктор тяжелого СГЯ.
Протокол с антагонистами ГнРГ: замена триггера овуляции
Используемый триггер – трипторелин.
При пункции большого количества фолликулов рекомендуется сегментации цикла с отказом от переноса эмбриона (ПЭ) и криоконсервация.
АнтГнРГ вводятся по 0,75 мг через 2 часа после трансвагинальной пункции, либо 3-4 дня подряд по 0,25 мг. Возможно совместное использование с каберголином по 0,5 мг х 5-8 дней (доказана эффективность в профилактике СГЯ).
Антагонисты ГнРГ в профилактике и лечении СГЯ:
* местный эффект: рецепторы ГнРГ в ткани яичников (Peng et ai., 1994 г.);
* изменение внутриклеточной передачи сигнала при сохранном стероидогенезе в яичниках (Ortmaan et al., 2001 г.);
* уменьшение секреции СЭФР в культуре клеток гранулезы в присутствии антагонистов ГнРГ (Asimakopoulos et al., 2006г.).
Если при использовании длинного протокола созревает большое количество промежуточных фолликулов, в конце назначаются антагонисты ГнРГ с целью уменьшения секреции СЭФР.
Эмбриологические показатели и частота наступления беременности: сравнительная характеристика
Замена триггера чХГ на а-ГнРГ – РКИ 2016 г.:
* значимых различий по числу полученных ооцитов и эмбрионов, перенесенных эмбрионов не выявлено;
* в группе замены триггера отмечена высокая частота наступления беременностей и имплантации;
* наблюдается тенденция к улучшению эмбриологических показателей.
Синдром незрелых ооцитов
Характеризуется получением ˃ 25% незрелых ооцитов (Bar-Ami et. al., 1994 г.).
Сообщения о достижении успешных беременностей в разные годы на фоне применения аГнРГ в качестве триггера, позволяют сделать следующие выводы:
* получение большего количества зрелых ооцитов и увеличение частоты оплодотворения у пациенток с повторными циклами незрелых ооцитов + EFS.
* число зрелых ооцитов ↑ на 28% в группе при применении а-ГнРГ + чХГ по сравнению с группой чХГ.
Выводы мета-анализов 11 РКИ 2011г. (n=1055) и 17 РКИ 2017 г. (n=787) по замене триггера овуляции
* При нормоответе и предполагаемом переносе эмбриона рутинное применение а-ГнРГ в качестве триггера овуляции не рекомендуется в виду снижения частоты рождения живых детей и прогрессирующей беременности.
* Исключение составляют пациентки с высоким риском СГЯ, донорские программы и случаи предимплантационного генетического скрининга с информированного согласия женщины.
Агонисты ГнРГ в профилактике СГЯ
Преимущества:
* более физиологичный выброс ГТ;
* сопоставимая эффективность при модифицированной поддержке лютеиновой фазы со стандартным протоколом;
* персонализация протокола для конкретной пациентки;
* меньший дискомфорт пациентки в лютеиновой фазе.
Недостатки:
* аномальная лютеиновая фаза;
* низкая эффективность циклов без модифицированной поддержки ЛФ;
* отсутствие консенсуса по дозе аГнРГ в качестве триггера овуляции;
* тщательный гормональный мониторинг посттрансферного периода.
Возможности:
* разработка индивидуальных схем;
* лучшая безопасность для пациенток и доноров ооцитов;
* персонализация протокола для конкретной пациентки;
* сегментация цикла.
Нерешенные вопросы:
* недоступность необходимых малых дозировок чХГ в некоторых странах;
* индивидуальные особенности пациенток;
* преждевременные Кокрановские обзоры и мета анализы не вносят свой вклад;
* клиническая резистентность врачей: по данным проведенного интернет опроса в 2013 г. (Великобритания, страны Европы) частота использования а-ГнРГ в качестве триггера – 5,2-36,1%.
Лютеиновая фаза в цикле с заменой триггера заведомо неполноценна.
Поддержка ЛФ в программах ВРТ при замене триггера овуляции
Схемы в зависимости от используемого триггера: чХГ, а-ГнРГ или экзогенные стероиды (ЭС).
Оказываемое влияние на исходы программ ВРТ
Мета анализ: 7 исследований, N = 745
* При «усиленной» поддержке: чХГ однократно/многократно, рЛГ, высокие дозы прогестерон (П) + эстрогены (Э) – ЧНБ не страдает.
* При стандартной поддержке: Э + П, ЧНБ значимо ниже. По протоколу Humaydan введение высоких доз прогестерона и эстрадиола дает хорошие результаты. Но дозы слишком велики и не прописаны в аннотациях, действующих в РФ.
Варианты модифицированной поддержки ЛФ после введения а-ГнРГ (2012 г.)
* Протокол – показание:
* интенсивная лютеиновая поддержка – уровень эстрадиола ≥ 4000 пг/мл;
* а-ГнРГ и чХГ 1000 МЕ – уровень эстрадиола ˂ 4000 пг/мл;
* а-ГнРГ и чХГ 1500 МЕ через 35 часов при ˂ 25 фолликулах;
* криоконсервация всех ооцитов и эмбрионов при ≥ 25 фолликулах.
Выводы Humaydan, 2012 г.
* Несмотря на отсутствие статистической значимости, однократное болюсное введение чХГ в дозе 1500 МЕ после использования а-ГнРГ в качестве триггера сопровождается снижением частоты СГЯ у пациенток с 15-25 фолликулами Д ≥ 11 мм при сохранной частоте наступления беременностей.
* Следует избегать двукратного болюсного введения чХГ 150 МЕ в связи с риском СГЯ.
N.B.
* В литературе описаны случаи развития тяжелой формы СГЯ после использования а-ГнГР в качестве триггера в протоколе овуляции с антагонистами ГнГР без введения чХГ для поддержки ЛФ.
* Несмотря на нормоответ (7-8 фолликулов), возможно, развитие тяжелой формы СГЯ по причине полиморфизма рецепторов, отвечающих за частоту развития СГЯ.
Поэтому рекомендуется придерживаться стратегии freeze all.
Концепции сегментации
* Стимуляция яичников: протокол стимуляции с антагонистом ГнГР и триггеринг ГнРГ.
* Оптимальная криоконсервация: витрификация ооцитов/эмбрионов.
* Идеальное определение времени для переноса эмбриона: перенос в последующем цикле.
Сохранение возможности ПЭ в свежем цикле – новая концепция
Варианты поддержки:
* а-ГнРГ+чХГ 1500МЕ в день ТВП+ЭС;
* а-ГнРГ+чХГ (двойной триггер) +ЭС;
* а-ГнРГ+ЭС;
* а-ГнРГ+рЛг+ЭС;
* а-ГнРГ+чХГ 1500МЕ в день ТВП и через 4 дна без поддержки ЭС;
* а-ГнРГ+125 МЕ чХГ без поддержки ЭС;
* а-ГнРГ + ежедневный мониторинг уровня прогестерона для определения дополнительного введения чХГ (Р˃30 ннмоль/л или 9,43 нг/мл, Е2˃100пг/мл – в 90% удалось добиться наступления беременности).
Усиленные схемы поддержки ЛФ при замене триггера увеличивают ЧНБ и частоту рождения живых детей. При этом частота СГЯ на фоне применения этих схем остается низкой.
Перспективы
Следует обсуждать freeze-all strategy, поскольку летальных случаев быть не должно.
Kiss-пептины – эндогенные гипоталамические пептиды:
* регулируют продукцию ГнРГ;
* играют ключевую роль в репродуктивной функции (наследственная гиперактивация – преждевременное половое созревание, наследственный дефицит – задержка полового созревания и бесплодие);
* экзогенное введение кiss-пептинов стимулирует продукцию гонадотропинов за счет индукции ГнРГ.
Возможности Kiss-пептина-54:
* стимуляция гипоталамо-гипофизарной-гонадной оси у мужчин: ↑ ЛГ, ФСГ, Т;
* стимуляция «пульсирующей» продукции ЛГ у женщин, особенно в преовуляторную фазу;
* стимуляция секреции гонадотропинов при гипоталамической аменорее: через 2 недели непрерывного введения — десенситизация, введение 2 р. в неделю — ↑ ЛГ и ФСГ;
* не влияет на продукцию СТГ, пролактина, ТТГ;
* триггер овуляции в программах ВРТ.
Тестирование доз кiss-пептина в качестве триггера овуляции вместо аГнРГ
2017 г. – вторая стадия клинических испытаний (Великобритания).
48% женщин (из 62 женщин) имели ˃ 25 фолликулов Д ˃ 10 мм на день введения триггера овуляции:
* Кiss-пептин-54 (9,6 нмоль/кг – 1 доза) за 36 часов до овуляции;
* Кiss-пептин-54 (9,6 нмоль/кг – 2 дозы) через 10 часов после овуляции;
98,4% - свежий ПЭ:
* частота имплантации после 1 дозы – 23,3%, 2 доз – 37, 1%;
* частота живорождения после 1 дозы – 19,4 %, 2 доз – 39%;
* частота СГЯ – 1,6% в каждой группе.
Федеральные рекомендации по профилактике СГЯ
Метод:
* аспирация максимального числа фолликулов;
* применение антагониста ГнРГ 0,75 мг/пк однократно или 0,25 в течение 3-4 дней.
Показание: ˃ 15 фолликулов Д ˃ 12 мм.
Метод:
Отказ от ПЭ в текущем цикле с криоконсервацией и ПЭ в не стимулированном цикле.
Показание: ˃ 15 ооцитов.
Метод:
* замена триггера овуляции чХГ на а-ГнРГ;
* агонисты D2-рецепторов (каберголин 0,5 мг/сутки – 5-8 дней).
Показание: ˃ 15 фолликулов Д ˃ 12 мм.
N.B. Новые рекомендации ожидаются в январе 2018 г.
Выводы по применению аГнГР в качестве триггера овуляции
* Профилактика СГЯ.
* Программы для доноров ооцитов и ПГС
* Все клинические случаи, когда ПЭ в стимулируемом цикле не планируется.
Вопросы
При одинаковых условиях ведения и гормональном фоне у некоторых пациенток после введения триггера повышается ЛГ, у них же ЛГ иногда не повышается. С чем это связанно?
В литературе обсуждается этот вопрос. Точного ответа нет. Вероятно, у таких пациенток выше шансы на наступление беременности при выполнении ПЭ.
Что такое современная технология в IVF лаборатории?
Структура IVF лаборатории
* Величина IVF лаборатории зависит от планируемой нагрузки: число OPU, других процедур и мониторингов, число персонала (врачи, сотрудники лаборатории, вспомогательный персонал).
* Перестраивание IVF лаборатории происходит каждые 5-8 лет: увеличение потока пациентов, неприспособленность помещений, новые требования к лабораториям, сертификация или аккредитация.
Основные принципы организации работы IVFлаборатории
1. Разделение рабочих обязанностей с учетом нагрузки на человека. Минимум 2 эмбриолога даже для самой маленькой лаборатории.
2. Организация контроля качества в лаборатории и в центре.
3. Создание Руководства с описанием стандартных методов работы: SOPs.
4. Обучение персонала лаборатории: начальное и ежегодное.
5. Ведение электронной базы данных по пациентам, циклам лечения и процедурам.
Отличительные особенности отделения ЭКО и IVF лаборатории
1. Дизайн IVF лаборатории с использованием элементов «чистых помещений». Одним из важных моментов является антистатическое покрытие полов, которое не позволяет оседать частицам пыли, и они легко выводятся из помещения через вытяжку.
2. Соответствие современным стандартам, предъявляемым к медицинским учреждениям данного типа в мире и в России.
3. Наличие системы контроля качества в лаборатории: мониторинговые системы «рН online», универсальная система «Boomerang».
4. Обеспечение современным оборудованием.
5. Специализированная база данных IVF.
6. Использование элементов «чистых помещений»: стандартный микроклимат и оптимальные условия культивирования эмбрионов и работы персонала.
7. Централизованная подача газов в лабораторию по газопроводам с автоматическим переключением баллонов. Система подает сигнал о том, что запасы газа иссякают еще за неделю или даже месяц.
8. Достаточное количество резервуаров для раздельного хранения замороженных материалов в крио-лабораториях.
9. Возможность использования лаборатории в качестве учебной базы и проведения научных исследований.
Задачи клинической лаборатории эмбриологии
1. Выбор эффективных методов культивирования эмбрионов.
2. Использование и совершенствование методов селекции гамет и эмбрионов.
3. Мониторинг условий культивирования и эффективности работы лаборатории.
4. Использование современного оборудования и современных методов для микроманипуляций.
5. Применение эффективных методов замораживания гамет и эмбрионов.
6. Использование современных методов генетического скрининга эмбрионов и ПГД.
Техника культивирования, в первую очередь, нацелена на подбор оптимального оборудования, среды и метода. На сегодня наиболее используемый метод — это применение одношаговых сред.
Условия культивирования эмбрионов
* Веретено деления в метафазе II — наиболее чувствительная органелла яйцеклетки, и потеря температуры на этом этапе, делает бесполезным все остальные действия в течение последующих дней и значительно снижает качество эмбриона.
* Важно использовать низкокислородную среду для снижения рисков повреждения эмбриона (планшетные инкубаторы легко позволяют этого добиться). Чем дольше экспонируется эмбрион вне организма матери, тем больше рисков у него существует.
Селекция сперматозоидов
* Стандартное применение центрифугирования в градиенте. Также позволяет в некоторой степени снизить частоту встречаемости фрагментированной ДНК.
* Селекция сперматозоидов при большом увеличении (IMSI).
* Применение тестов селекции зрелых и незрелых сперматозоидов.
* Применение новых методов, которые пока не нашли широкого применения.
Поляризационная микроскопия позволяет оценивать качество яйцеклетки по состоянию блестящей зоны — неравномерное окрашивание свидетельствует о низком качестве и плохом прогнозе. Метод пока не нашел широкого применения в России.
Лазер в эмбриологии используется широко и в последнее время нашел еще одно применение — формирование отверстия в яйцеклетке для ИКСИ. Блестящая зона является самым твердым участком яйцеклетки и прокол в этой зоне позволяет легко провести все манипуляции, избежав излишней компрессии. Результаты проведенных исследований демонстрируют хорошие результаты — эмбрионы высокого качества.
В России организация лаборатории базируется на приказе №107, положения которого являются недостаточными.
В европейских странах организация лаборатории базируется на директиве европейского парламента, целью которого является создание безопасных условий работы, хранения и трансплантации клеток и тканей человеку. Безопасность для: пациента, персонала, материала и окружающей среды.
Параметры мониторинга в IVF лаборатории
* Температура в инкубаторах (внешнее измерение).
* Концентрация СО2 в инкубаторах.
* Влажность в инкубаторах.
* Температура и влажность в помещении лаборатории.
* Температуры в холодильниках — условия хранения сред (температурные датчики).
* Мониторинг частиц — пылевая контаминация.
* Уровень азота в резервуарах — хранилище гамет, эмбрионов и тканей.
* Уровень О2 в криохранилище — опасность для персонала.
* Микробиологический мониторинг помещения — рабочие поверхности и руки персонала.
* Мониторинг рН сред в инкубаторах.
Для контроля и централизации всех параметров могут использоваться разные системы, одна из которых «Boomerang», позволяющая через интернет вывести все установки на монитор и контролировать их показатели.
Преконцепционный генетический скрининг моногенных заболеваний на основе MPS (NGS)Васильев Р.В.
Тест NextGen21 — применение
* Генетическое тестирование родителей на носительство наследственных заболеваний (НЗ).
* Создание криобанка донорских гамет с известным генетическим статусом.
В марте 2017 года ACOG выпустила 2 документа, которые содержат общие рекомендации по применению тестов на носительство НЗ. Отмечается необходимость информирования всех беременных женщин о существовании подобных исследований и цели их проведения. Рассматривается последовательность ведения беременных женщин — носительниц НЗ.
Также один из документов содержит общие рекомендации по разработке и применению этнических, панэтнических и расширенных скрининговых тестов на носительство НЗ. Определяет критерии выбора НЗ, входящих в состав панели (носительство не менее 1:100, тяжелые последствия, ранняя манифестация, четкий фенотип и т.д.).
Выбор заболеваний для панели
* Высокая популяционная частота.
* Известная генетическая этиология.
* Известный тип наследования.
* Тяжесть манифестации.
* Высокая пенетрантность.
* Позднее фенотипическое проявление.
* Методические рекомендации.
Состав панели (версия 1.1): муковисцидоз, фенилкетонурия, миодистрофия Дюшена, гемофилия А, бета-таласемия, серповидно-клеточная анемия, семейный аденоматозный полипоз I и II типа, мукополисахаридоз I типа, аутосомно-доминантный поликистоз почек I и II типа, б-нь Шарко-Мари-Тута, б-нь Гиппеля-Линдау, б-нь Вильсона-Коновалова, б-нь Гоше, б-нь Тея-Сакса, наследственный рак молочной железы и яичников I и II типа.
Версия панели не окончательная, возможно добавление новых заболеваний или исключение уже имеющихся.
Импорт клинически значимых вариантов в базу данных SegDB
Использовались следующие источники
* Кодирующие последовательности регуляторные участки сайты слайсинга (последовательности, которые с наибольшей вероятностью приведут к патогенному фенотипу).
* Методические рекомендации и гайдлайны по отдельным заболеваниям, включенным в панель.
* Публичные базы данных HDMD ClinVar (информация о клинической значимости тех или иных вариантов).
* Локус-специфичные базы данных — наиболее информативный участок, поскольку эти данные курируются и поддерживаются в актуальном состоянии.
На основании этих данных было собрано 15900 клинически значимых вариантов.
Верификация теста NextGen21
Проводится как референсным методом, так и при помощи контрольных образцов.
Секвенирование по Сангеру
Верификация по генам CFTR и PAH по 20 клиническим образцам из биобанка Parseq Lab. Использовали контрольный образец здорового пробанда из Национального Института Стандартных Технологий, имеющий качественные характеристики в масштабах полного генома. А также 21 контрольный образец из проекта (The 1000 Genomes), худшего качества.
Верификация теста NextGen21 в итоге показала высокую общую точность — 99,99%.
На практике, интерпретатор (врач-генетик) сравнивает найденные варианты с базой данных по клинической значимости найденных вариантов.
При использовании теста было отмечено снижение остаточных рисков в паре с одним носителем в 20-40 раз и в паре без носителя в 1010 раз. При тестировании кандидатов в доноры были обнаружены мутации, которые остались бы не диагностированными при использовании других методов.
Интересные находки при использовании панели
Частый вариант E217G в гене CFTR
* Частота аллеля в популяционных базах данных — 0,3-0,4%.
* Частота аллеля в нашей выборке (167 образцов) — 1,19%.
* Ассоциирован с мягкой формой муковисцидоза.
* Не входит в состав тестов на мажорные варианты в гене CFTR.
Взаимно компенсирующие варианты в гене АТР7В (б-нь Вильсона-Коновалова)
Находятся близко поэтому компенсируют друг друга и клиническую значимость определить сложно. Каждая из этих мутаций в отдельности, ассоциирована с развитием заболевания.
NextGen21 — заключение
* Разработан и внедрен в практику тест на носительство 18 НЗ, отмечены высокие аналитические характеристики.
* Метод опробован на 120 донорах гамет, 24 образцах контрольной ДНК и 23 пациентах.
* Среди уникальных вариантов обнаружено 28 патогенных/вероятно патогенных согласно международным рекомендациям ACMG п интерпретации MPS.
* С помощью теста удалось обнаружить у потенциальных доноров носительство миодистрофии Дюшена и гемофилии А и впоследствии исключить их из донорской программы. Кроме того, обнаружены редкие патогенные варианты в генах CFTR и РАН, которые были бы пропущены скрининговыми методами, ограничивающимися только мажорными патогенными вариантами.
Кому можно рекомендовать тест NextGen21
* Планирующим ребенка.
Особенно
* Если в семье были случаи НЗ.
* Если семейный анамнез по НЗ неизвестен.
* В случае кровнородственного брака.
* Этническим группам с повышенным риском.
* При планировании программы ЭКО с участием донора.
* Всем донорам в программе ВРТ.
Самолет не полетит» или почему NGC такая как естьNGC — сеть клиник репродукции
* Не нужно путать NGC с технологией высокопроизводительного секвенирования NGS или MPS.
* Сеть будет расти (В РФ МСК и СПб).
* Более 120 сотрудников (4 юридических лица).
* Специализирована на репродукции (ВРТ) и генетика, андрология.
* Не предусмотрена широкая оперативная активность.
* Не работает в системе ОМС, которая на данном уровне не оптимальна (коррупция в ОМС не отвечает этическим принципам сети).
* В решении максимум усилий до ЭКО.
* ЭКО несет определенные проблемы для детей и женщин, но для многих ВРТ является единственной возможностью.
Принципы
* Максимум один здоровый ребенок за одни роды.
* Минимум осложнений и дискомфорт паре.
Преконцепционный скрининг
Это тренд во всем мире как путь к рождению здорового ребенка. С учетом того, что моногенные заболевания — это трагедии отдельных семей (обуславливают 20% детской смертности, 18% педиатрических госпитализаций), внедрение NGS поможет избежать рождения таких детей.
Если провести аналогию с с. Дауна, то внедрение скрининга позволило резко снизить число детей, родившихся с этим диагнозом.
NGS скрининг на моногенные заболевания
Каждый человек является носителем 2,3 серьезных мутаций в среднем и при совпадении этих мутаций в паре, рождается больной ребенок.
Кому
* Донорам ооцитов и спермы.
* Парам, планирующим беременность (согласно данным одного из исследований, лишь 16% пар не являются носителями серьезных мутаций).
* Популяция, новорожденные.
Секвенирование более предпочтительно и перспективно по сравнению с генотипированием (определение только мажорных мутаций).
Размер панели — это спорный вопрос. Можно исследовать весь медицинский экзом (4000 ген), но в этом случае возникают трудности с интерпретацией результатов и консультированием. Также спорными вопросами являются включение в панель заболеваний с поздней манифестацией, интронные участки или предрасположенность.
Преимплантационное генетическое тестирование ПГТ-А (ПГС/ПГД) и как следствие СЭТ (перенос только одного эмбриона)
NGS/MPS — сегодня самая оптимальная технология.
У репродуктологов на сегодня нет единого мнения относительно ПГТ. Одни считают, что оно нужно всем, другие утверждают о неэффективности исследования, а третьи уверены, что необходимы четкие показания к проведению тестирования. И все ссылаются на различные исследования и мета-анализы, которые не всегда убедительны.
Таким образом, нет убедительных данных в неэффективности ПГТ, но и недостаточно публикаций обратного.
Путь NGC к NGS
* Осознание необходимости перехода на NGS в 2013 году, закупка оборудования.
* Разработка правил трофэктодермы для секвенирования — источник контаминации ДНК в 2015 году.
* Валидация метода на биоптатах анеуплоидных aCGH.
* Верификация NGS на аликвотах WGA при несовпадении.
* Первые клинические результаты ПГС на 24 хромосомы с NGS.
* Создание панели скрининга на моногенные заболевания (NextGen21).
Отличия NGS и aCGH
Были проведены различные исследования, которые показали, что метод NGS является более точным и четче селектирует эмбрионы — позволяет выявлять мозаичные эмбрионы в отличие от аCGH. И при сравнении этих методик, в том числе и со случаями без ПГС, были получены следующие результаты.
1. Клинические беременности: NGS — 71%, аCGH — 53%, без ПГС — 42,5%.
2. Б-ти после 12 недель: NGS — 66,7%, аCGH — 50%, без ПГС — 34,7%.
3. Аборты: NGS — 6,7%, аCGH — 5%, без ПГС — 15,5%.
4. Двойни: NGS — 0%, аCGH — 5%, без ПГС — 29,3%.
40 лет непрерывного повышения эффективности ЭКО
На данном этапе по ОМС в СПб в 2017 проспективные данные (более 700 циклов). Перспективными считались пациентки с АМГ более 1. При этом имплантационная частота при СЭТ — 22,37%. Но в более, чем 55% случаев проводился перенос 2 эмбрионов с частотой клинических беременностей — 34,6%.
Почему нужен полный хромосомный преимплантационный скрининг (ПГС-ПХС)?
Большинство эмбрионов анеуплоидны и гибнут сразу или до 8 недель гестации (кроме 13,18,21,Х,Y,16). Анеуплоидия самая частая причина неудач при ЭКО, и самая частая причина прерывания беременности, эмбрионы могут иметь сегментарные анеуплоидии или быть полиплоидными.
Целесообразность ПГС-ПХС — зачем нужна процедура?
* Повышение вероятности доношенной беременности и живорождения.
* Возможность переносить только один эмбрион и исключить двойни.
* Возможность не хранить анеуплоидные бластоцисты.
* Не переносить ненужное (эмбрионы, которые дадут больного ребенка или прерывание беременности).
* Сократить аборты и риски аномалий у детей.
* Сократить время до рождения ребенка и стресс.
* Сократить расходы на рождение 1 ребенка.
* Перспективы дальнейшего развития скрининга.
Проведение биопсии трофэктодермы и ПГТ позволяет своевременно выявить проблему и избежать последствий.
Зачем переходить от aCGH к NGS?
NGS более строго и четко селектирует эмбрионы.
Преимущества NGS значительны: более точное определение мозаицизма, сегментарных анеуплоидий, более привлекательная цена, которая постепенно снижается, и методика имеет большие перспективы. NGS уступает aCGH лишь во временных затратах и сложности.
PGDIS-2017, Valensia
Veriseg: выявление 20% мозаицизма при 4,5 Мб разрешения на моделях смеси клеток.
Мозаицизм
Доля мозаичных эмбрионов в будущем будет указывать на качество лаборатории.
Согласно данным опросов в 2015 и 2016 году:
* ПГТ проводилось всем лишь в 6% случаев и 90% по показаниям;
* в 2015 году биопсию трофэктодермы проводили лишь в 72% случаев в 2016 г. уже 90%;
* NGS 16% в 2015 году и 60,7% в 2016, на сегодня уже более 80%;
* Своя лаборатория в 2015 году была у 23%, к 2016 году — 52,5%. И большинство клиник склоняются к мнению, что наличие своей лаборатории повышает эффективность работы в целом, позволяет в 2 раза чаще переносить любых мозаиков.
Исходы родов после ЭКО — существующие проблемы
* После процедуры ЭКО при одноплодной беременности, выше частота преждевременных родов и рождения маловесных детей, чем при спонтанной одноплодной беременности.
* При переносе свежих эмбрионов после ЭКО, частота преждевременных родов выше, чем при криопереносе. Это дает основание полагать, что тот уровень эстрогенов, который формируется при стимуляции не является оптимальным для формирования хориона и плаценты.
Пути минимизации осложнений и дискомфорта пары
* Сегментированный цикл с триггером Трипторелин 0,1 мг п/к. Опыт 17 лет и тысяч циклов ДО и ПГТ. Позволяет полностью исключить синдром гиперстимуляции яичников.
* Стимуляция во второй фазе МЦ — 12 (16) день. Минимизирует стресс и дискомфорт, частоту инъекций и визитов. Время на цикл от начала КОС до ПЭ стандартное.
* Минимум инъекций, мониторированных визитов, обследований. Чем меньше испытывает стресс пациентка, тем больше вероятности, что она вернется, если попытка ЭКО будет неудачной. Применение корифоллитропина дает возможность минимизировать частоту инъекций и визитов (начало стимуляции и 7 день).
Преимплантационное тестирование и технические, биологические ограничения. Пересмотр тактики при мозаицизмеВяткина С.В.
Цель любой клиники ВРТ — рождение здорового ребенка, однако, значительная часть циклов ЭКО заканчивается неудачей именно по причине хромосомной патологии. Но несмотря на это, в большинстве клиник ВРТ селекция эмбрионов основана исключительно на морфологии, которая не коррелирует с хромосомным статусом эмбриона. Поэтому, проведение ПГД эмбрионов является выходом в данной ситуации.
Методы ПГС претерпели значительные изменения и в течение последних лет отдается большее предпочтение методу NGS, который является более чувствительным, чем сравнительная геномная гибридизация и позволяет обнаруживать мозаичные эмбрионы более достоверно (17% против 9% при использовании aCGH).
Согласно различным данным, эмбрионы 5-6 дня несут в себе 20-40% хромосомного мозаицизма. С учетом такой высокой частоты возникают вопросы: как интерпретировать результаты и экстраполировать на весь эмбрион, является ли мозаичный эмбрион патологическим и пригоден ли он для подсадки.
Важно понимать, что мозаицизм бывает разным (трофэктодерма, внутренняя клеточная масса), поэтому в зависимости от локализации биопсии можно получить ложноположительный или ложноотрицательный результат.
Согласно данным проведенных исследований, в 41-44% случаев, мозаичные эмбрионы не имели хромосомной патологии (повторно была проведена биопсия внутренней клеточной массы). Таким образом, мозаичные эмбрионы будут нести в себе хромосомную патологию лишь в половине случаев. Это дает основание отнести мозаиков к третьей категории хромосомного статуса эмбриона наряду с нормой и патологией.
Перенос мозаичных эмбрионов ассоциирован с более низкой частотой наступления беременности и ее прогрессирования, с более высокой частотой прерывания беременности. Поэтому решение о переносе мозаиков остается за клиникой.
* Рекомендованы к переносу эмбрионы с отсутствием хромосомных аномалий.
* Не рекомендованы эмбрионы с численными и структурными аномалиями, выявленными во всех клетках.
* Могут быть перенесены эмбрионы с хромосомной патологией в мозаичном варианте, но таким пациенткам рекомендовано медико-генетическое консультирование (амниоцентез).
Эмбрионы с более низким процентом анеуплоидных клеток имеют более высокий имплантационный потенциал. И если в 2016 году речь шла о том, что эмбрионы с мозаичной формой моносомии имеют более высокий имплантационный потенциал, то в 2017 году было доложено о том, что их имплантационный потенциал аналогичен таковому у эмбрионов с мозаичными трисомиями и сегментарными анеуплоидиями.
Заключение
* Метод NGS более чувствителен по сравнению с aCGH и позволяет выявить 20% мозаицизм.
* Не всегда выявленный в образце трофэктодермы мозаицизм отражает истинный хромосомный статус эмбриона.
* Мозаицизм — третья категория хромосомного статуса эмбриона.
* Подсадка мозаичных эмбрионов возможна, но требует медико-генетического консультирования.
* Необходима четкая совместная работа: лаборатория/клинический генетик/лечащий врач/пациент.
* Мозаичные эмбрионы имплантируются с меньшей вероятностью, чем эуплоидные эмбрионы.
* Беременность после подсадки мозаичных эмбрионов прерывается чаще, чем беременность эуплоидными эмбрионами.
* Мозаичные эмбрионы могут привести к рождению здорового ребенка.
* Рекомендована пренатальная диагностика — амниоцентез.
Мужской фактор бесплодия: нужно ли готовить мужчину к ЭКО?Боголюбов С.В.
Диагностика. Спермограмма (ВОЗ, 2010 г.)
По данным 3265 спермограмм норма наблюдается лишь у 17,2%, азооспермия – 8,3%, другие варианты нарушений – 74,5%.
Частота наступления беременности (ЧНБ) в программах ИКСИ и ЭКО
По данным РАРЧ ЧНБ – около 30%. За последние 15 лет показатели практически не увеличилась – несмотря на новые технологии и препараты.
ЭКО – не панацея»! Мы лишь позволяем встретиться половым клеткам.
Азооспермия – наиболее тяжелая форма патозооспермии
Характеризуется отсутствием сперматозоидов в эякуляте при не менее, чем 2-х разовом исследовании центрифугированной семенной жидкости. Частота 1% в популяции, 10-15 % — инфертильных мужчин.
Комплексное обследование для выявления формы:
* ФСГ и ингибин В в сыворотке крови;
* оценка объема яичек и структура придатков;
* в эякуляте гликозидаза, фруктоза и лимонная кислота;
* цитогенетические и молекулярные исследования для определения кариотипа в локусах AZF Y хромосомы и CFTR.
Методы лечения
Наиболее продвинутая технология в решении вопроса необструктивной азооспермии – микрохирургическая биопсия яичка (microTESE).
Принцип: найти в ткани яичка расширенный семенной каналец, в котором протекает сперматогенез. Спавшиеся и тоненькие канальцы – не функционирующая ткань.
Главная цель – не увеличение, а уменьшение количества удаляемой тестикулярной ткани.
Преимущества microTESE:
* высокая результативность в получении сперматозоидов: при НОА – 63%, открытой биопсии – 45%;
* масса забираемой ткани – до 10 мг, против – 720 мг при обычной биопсии;
* получение сперматозоидов у пациентов с с-мом Кляйнфельтера (66%).
Недостатки: не всегда позволяет количественно оценить гистологическое распределение сперматогенеза.
Клинические результаты – из собственного опыта ↑ 200 вмешательств
* При обструктивной азооспермии (ОА) – 56 случаев: ЧНБ – 50%, роды – 24, рождение – 27 детей.
* При необструктивной азооспермии (НОА) – 91 случай: ЧНБ – 43,9%, роды – 31, рождение – 34 детей.
* ОА+НОА – 74 случая: ЧНБ – 32,4%, роды – 18, рождение – 20 детей.
Всего: 224 случая, ЧНБ – 41,6%, роды – 73, рождение – 87 детей.
Резюме:
* результативность не зависит от уровня ФСГ, ингибина В, объема яичек, наличия, количества и заключений предшествующих биопсий;
* имеют значение анамнестические данные и наличие генетических мутаций;
* заключение о наличии сперматозоидов по гистологическому материалу более чем в 50% случаев не совпадает с их обнаружением в нативных биоптатах (шансы найти сперматозоиды всегда велики);
Как улучшить результативность ЭКО у пациентов с азооспермией?
* Качественное оснащение операционной.
* Техника и тщательность выполнения оперативного вмешательства. Если в одном яичке не найдены расширенные семенные канатики, необходимо искать во втором.
* Опыт хирурга.
* Возможности эмбриологической лаборатории.
* Выполнение биопсии в свежих циклах, особенно при получении единичных сперматозоидов (невозможность провести тест на криотолерантность).
* Подготовка пациента к биопсии.
Задачи лечения при азооспермии
Подготовка к ЭКО проводится у пациентов с нарушениями в спермограмме, к которым относится и азооспермия. Важно не только найти сперматозоиды у таких пациентов, но и обеспечить их способность к оплодотворению и как следствие — добиться рождения живого здорового ребенка.
Гипотиреоз
Имеется прямая корреляция с морфологией спермы. При коррекции состояния улучшается качество сперматозоидов.
Варикоцеле
(n=98) – наблюдение клиники
* имеет каждый 3-4 обратившийся пациент;
* средний возраст – 33,7 лет;
* длительность бесплодия – 1-14 лет;
* сочетание с женским фактором – 24,5%;
* первичное бесплодие – 60,2% (60 случаев).
Спермограмма:
* объем ˂ 2 мл – 15 чел.;
* количество сперматозоидов ˂ 15 млн/мл (олигоозоспермия) – 40 чел.;
* азооспермия/критоспермия – 9 чел.;
* подвижность типа А ˂ 25% (астенозооспермия) – 89 чел., типа А+В ˂ 50%.
Ультраструктурные нарушения сперматозоидов как фактор инфертильности
У нормального сперматозоида имеется хорошее пентагональное ядро, правильные акросомы, центриоль, участвующая в образовании веретена деления.
Измененный сперматозоид имеет неконденсированный с незавершенной упаковкой хроматин, распаковка которого нарушается при попадании сперматозоида в яйцеклетку. При наличии в эякуляте таких сперматозоидов ˃ 30% возникают проблемы с программами ЭКО (выкидыши, остановки развития эмбрионов на 3-4 день).
Неконденсированный хроматин у ˃ 30% сперматозоидов имеется у каждого 2-го пациента с варикоцеле.
Фрагментация ДНК сперматозоидов как фактор инфертильности
Супружеские пары, в которых мужчина имеет ˃ 30% сперматозоидов с фрагментацией ДНК, ˂ 1% случаев наступает естественная беременность.
Исходы беременности в зависимости от фрагментации ДНК
Проанализировано 8068 ЭКО (2017 г) – ИКСИ/IVF
Вывод: фрагментация ДНК незначительно сказывается на эмбриологическом этапе, но отрицательно влияет на клиническое наступление беременности.
Фрагментация ассоциирована с приемом лекарственных препаратов, особенно – антибиотиков (наиболее токсична группа доксициклина).
Статистически достоверные различия в разных группах при лечении варикоцеле
I группа – склероэмболизация, II группа – без лечения:
* процент фрагментации ДНК сперматозоидов: I группа – 10.2 ± 2.3, II группа – 27.3 ± 3.3;
* средний уровень активных форм кислорода: I группа – 1.3 ± 0.3, II группа – 2.8 ± 0.3;
Применение рекомбинантных ФСГ (рФСГ) для коррекции тератозооспермии
На нормализацию компактизации хроматина оказывает влияние 150 МЕ рФСГ в/м ежедневно в течение 12 недель – необходимо для развития эмбриона.
Условия: нормогонадотропное состояние пациентов, исключены инфекции, варикоцеле, идиопатическая тератозооспермия.
Анеуплоидии сперматозоидов
Метод выявления: применяется флуоресцентная гибридизация in situ для хромосом: X, Y, 13, 18 и 21.
При оплодотворении сперматозоидом с 2-х YY хромосом, 2-х 21, 13 или 18 хромосом, эмбрион останавливается в развитии.
Что влияет на анеуплоидию?
Повреждения генетического материала, А+В подвижность и фрагментация ДНК. Чем хуже сперммограмма, тем выше (до 10 раз) частота анеуплоидий в сперматозоидах;
Взаимосвязь анеуплоидий сперматозоидов и генетического статуса эмбрионов
(Rodrogo L., 2010 г)
* У пациентов с анеуплоидиями в сперматозоидах выше количество анеуплоидных эмбрионов. В контрольной группе – 32%, с анеуплоидиями – 60%
* Встречаются дисомии, анеуплоидии, XXY-синдром.
* Анеуплоидии сперматозоидов напрямую коррелируют с мозаицизмом эмбрионов – нарушается митоз.
Показания к ПГД/ПГС со стороны мужчины в программах ЭКО
* Все виды генетической патологии, выявленной у мужчины, влияющие на мейоз.
* Наличие варикоцеле при отказе от оперативного лечения.
* Тяжелая олиготератозооспермия.
* Задержка развития эмбрионов, неудачи имплантации, ранее прерывание беременности в предыдущих программах ВРТ.
* Привычный выкидыш у партнерши в естественном цикле при повышенном уровне анеуплоидий в сперматозоидах.
* Химио- и лучевая терапия в анамнезе.
Анеуплоидии сперматозоидов: что предпринять?
* Коррекция образа жизни: отказ от курения.
* Исключение гонадотоксических факторов: контакт с бензолсодержащими веществами.
* Оперативное лечение варикоцеле.
* Нормализация нарушенных обменов и уровня половых гормонов.
* Генетическое консультирование и рекомендации по применению ПГС/NGS в программах ВРТ при выявлении повышенного уровня анеуплоидий сперматозоидов, возраст мужчины ↑ 40 лет.
Фокус на соматическое здоровье
Коррекция состояний, приводящих к мужскому бесплодию: ожирения, эректильной дисфункции, гипогонадизма, хронического простатита, дислипидемии, инсулинорезистентности, депрессии.
Низкий тестостерон – предиктор снижения SRR и качества сперматозоидов
Для улучшения ситуации существует множество неоднозначных подходов: использование ХЧГ, блокаторов ароматазы, тестостерона и др.
Заключение
* Мужской фактор в виде морфологии сперматозоидов является лимитирующим в выборе программ ВРТ.
* Мужчина не должен быть «пассивным фактором» в программах ВРТ.
* Проведение комплексного обследования мужчины позволяет выявить факторы, приводящие к неудаче ВРТ, в т.ч., при нормозооспермии.
* Улучшение морфологии сперматозоидов при подготовке к ВРТ – резерв в повышении результатов лечения.
* Обязательное дообследованние мужчины при неудачных попытках ЭКО, выкидышах у партнерши в анамнезе: оценка спермы по критериям Крюгера, фрагментация ДНК сперматозоидов, генетический анализ, УЗИ органов мошонки, посевы спермы на флору.
Биопсия трофэктодермы – бесценный опыт
Павлова М.Н.
С апреля 2015 г. по ноябрь 2017 г. пробиописированно 1353 протокола (4 986 эмбрионов). За 1-й год работы два человека осуществляли биопсию, 2-ой – три.
Организация работы лаборатории с учетом выполнения большого количества биопсий
* Осуществление биопсии отдельным сотрудником в отдельном помещении на протяжении половины рабочего дня для исключения возможности совершения ошибок.
* Организация рабочего места.
* Выполнение биопсии, заморозки и тюбинга в короткие сроки.
* Обучение сотрудников, совершенствование навыков.
Временные затраты на биопсию для одного опытного эмбриолога в условиях лаборатории – 1-2, мах. – 3 мин., по данным литературы – 3 мин. в среднем
Оценка уровня контаминации ДНК в протоколе биопсии трофэктодермы
Совместно с компанией «Parseq Lab» проведен эксперимент.
Цели: определение наличия и источника контаминации образцов биоптата в протоколе биопсии трофэктодермы и выработка схемы внутреннего контроля качества для последующего ПГС.
Проводилась полногеномная амплификация (WGA). Проанализированы образцы: исходные растворы, растворы после эмбриона, промывочные для капилляра, биоптатные и отмывочные, взяты позитивные и негативные контроли.
Материал
* Исходные растворы – по 5 мл. в 2-х кратной повторности.
* Отрицательный контроль – вода 1 типа очистки.
* Положительный контроль – коммерческая геномная ДНК.
Фрагментные профили были обнаружены в положительных контролях и в каплях, где проводилась биопсия.
Результаты:
* эксперимент прошел внутренний контроль качества;
* все растворы протестированы на предмет контаминации ДНК;
* контаминация образцов обнаружена в месте проведения биопсии и промывочных каплях;
* в прочих растворах ДНК данным методом не обнаружена;
* определена половая принадлежность эмбрионов.
Выводы:
* Одни и те же пипетки можно использовать для проведения нескольких биопсий, если внутри них не произошел лизис клеток – удешевляет и упрощает проведение процедуры.
* Желательно иметь дополнительные капли для промывок биоптата.
* Слабая информативность метода выбора отрицательного контрольного образца из последней промывочной капли буфера (используется при CGH). В капле может оказаться ДНК промывавшегося эмбриона. Теряется смысл негативного контроля. Клиника отказалась от метода.
Надо ли делать всем, кто идет на генетическую диагностику – ICSI в принудительном порядке? Зачем? Можно ли использовать эмбрионы после ЭКО?
Не происходит контаминации ДНК сперматозоидов (Feklman, 2017 г.)
Наши данные:
* отсутствует необходимость в выполнении ICSI для исследования методом NGS – не влияет на качество диагностики;
* проанализировано 300 эмбрионов после IVF и ICSI – не выявлена разница в качестве графика и влияния на результат анализа.
Вывод
Нет необходимости выполнять всем ICSI. Следует выбирать метод (IVF/ICSI) в каждом конкретном случае по показаниям. Если сперма хорошего качества, нет необходимости переплачивать за процедуру.
Выбор дня биопсии
Учитывая тот факт, что пациенты клиник ВРТ в основном старшего возраста, рост бластоцист идет с некоторой задержкой, поэтому они могут дорастать до 6 и до 7 дня.
* На 5-ый день лучше выглядят профили, клетки меньше лизируются (Cаpalbo, 2015 г.).
* Биопсия на 6 день не хуже, чем на 5-ый день, если эмбрион хорошего качества (Kort, 2013 г).
* Эмбрионов с анеуплоидией на 6-ой день больше, чем на 5-ый, но среди эмбрионов 6-го дня около 48% эуплоидных (Davie, Owven, 2017 г).
Диаметр отверстия и день хэтчинга
Каждая клиника выбирает день хетчинга, исходя из графика работы.
Наш опыт
Хэтчинг на 4-ий день – биопсия только бластоцист, достигших стадии ВI5.
Морфология и связь с уровнем анеуплоидий эмбрионов
Проведены многочисленные работы: одни исследователи утверждают, что имеется взаимосвязь, другие ее отрицают.
Наш опыт
Проведен подсчет по 300 эмбрионам разного качества, выполнено сравнение их морфологии и эуплоидности.
Выводы:
* закономерности не выявлено;
* для биопсии можно использовать эмбрионы качества 3ВС и ↑.
Применение лазера
Не обнаружено влияние лазера на профиль ДНК и качество получаемых графиков (Dutton, 2017 г.).
Наш опыт
Исследовано 70 биоптатов, учитывалось количество импульсов лазера во время биопсии эмбрионов.
Выводы:
* отсутствует влияние лазера на качество профилей ДНК;
* использование лазера влияет на качество эмбриона и его способность к имплантации;
* для уменьшения возможных повреждений эмбриона необходимо минимизировать использование лазера.
Количество клеток для анализа
Должно быть ˃ 10, чтобы снизить количество выкидышей.
Для метода NGS 7,3 – клетки (Capalbo, 2015 г.).
Наш опыт
Необходимо ˃ 5 целых клеток (в среднем – 5-8) для получения достоверного результата.
Сколько хранится биоптат?
При комнатной t до 7 дней и более. Сохраняет свои свойства и при анализе «картинка» остается прежней.
Нужно ли проводить ре-биопсию?
Имеется риск для эмбриона: разморозка, повторная биопсия и заморозка, вновь разморозка перед переносом. Снижается процент наступления беременностей, но если эмбрион хорошего качества и эуплоидный, ре-биопсия не нанесет ему существенного вреда.
Пренатальное ДНК-тестирование — инновации 2017Кречмар М.В.
Пренатальное ДНК-тестирование стало прорывом в генетике и его рекомендуют все международные сообщества в качестве первого этапа пренатальной диагностики.
Неинвазивные пренатальные тесты (НИПТ) проводятся разными технологиями, но все направлены на выявление хромосомных аномалий в хромосомах: 21, 13, 18, Х, У.
Некоторые НИПТ в последние годы стали включать в свою панель микроделеционные синдромы, среди которых тест Panorama c 2013 года:
* 22q11.2 делеция.
* С-м Прадера-Вилли.
* С-м Ангельмана.
* С-м кошачьего крика.
* 1р36 делеция.
Микроделеционные синдромы крайне важны и по возможности должны диагностироваться, поскольку обуславливают очень тяжелые состояния.
Важно помнить, что разные НИПТ используют разные технологии и алгоритмы подсчета, что обуславливает их разные возможности.
В настоящее время валидированы три методики тестирования: S-MPS, T-MPS и SNP. Но каждая из них дает различное число ложных результатов. И если сравнить их между собой, выявляемость патологии при использовании SNP выше, чем суммарная у S-MPS и T-MPS.
Тест Панорама использует технологию SNP
SNP
Метод способен четко разделить плодную и материнскую ДНК и вести анализ хромосом по плодной ДНК. Основан на определении однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) в цепи ДНК, которые уникальны для каждого человека, тем самым точно определяя ДНК плода.
С 2017 года тест позволяет идентифицировать не только 2-х, но уже и 3-х разных индивидов (мать-плод-плод или мать-мать-плод), что расширяет возможности пренатальных исследований.
Тест Панорама, основанный на SNP показывает меньший уровень (в 7 раз меньше) ложноположительных результатов для 21,18 и 13 хромосом, чем другие технологии.
Преимущества идентификации разных индивидов
* Разделение генетического материала хромосом матери и плода.
* Идентификация плодных хромосом 21,13,18 и оценка их количества.
* Точное детектирование половых хромосом, количества X и Y.
* Оценка отдельных участков хромосом — микроделеций.
* Выявление дополнительного генома — второго замершего плода или триплоидии.
* Обнаружение присутствия иного генетического клона (трансплантат или онкоклон матери, возможно, фетальная опухоль плода).
Также тест Панорама позволяет выявить триплоидии, что очень важно при планировании будущих беременностей и сохранении здоровья женщины.
Выбор методики для разных групп пациентов
При одноплодной беременности и родственных плода и матери стандартно можно оценить количество хромосом, нарушение числа половых хромосом, микроделеции и триплоидии (только Panorama).
При многоплодной беременности и неродственных плода и матери (ДО, сурМ) возникают сложности: по детекции числа половых хромосом, определению генетического пола плода по присутствию У (от одного или 2-х плодов), % плодной ДНК одного плода может быть крайне низким, трисомия у одного или обоих плодов (?).
Какие возможности дает инновация 2017 года в технологии тестирования Панорама?
* Идентификация трех генотипов.
* Определение зиготности близнецов — наличие одного или двух генотипов плодного происхождения.
* Определение % ДНК для каждого дизиготного близнеца.
* Оценка рисков трисомий для каждого близнеца из дизиготной пары
* Выявление нарушений числа хромосом у плода биологически неродственного беременной (ЭКО — ДО и СМ).
Новые технология Панорама позволяют разделить генотипы матери и плодов
* Зиготность определяется путем сравнения полиморфизмов. По результату проводится оценка хромосомного материала по разным алгоритмам: материнская ДНК и плодная ДНК; материнская ДНК + ДНК одного плода + ДНК второго плода.
* Определяются половые хромосомы каждого плода при дизиготной беременности (пол одинаковый и разный).
* Определение зиготности включено в предварительный риск, сообщается в отчете.
Анализ дает возможность определения тактики ведения двуплодной беременности на основе зиготности плодов.
Определение хориальности — это оценка акушерских рисков
* Диагностические критерии: по данным УЗИ тип хориальности необходимо определить до 14 недель беременности (предпочтительно раньше).
* Оценивается: количество плодных яиц, наличие амниотической мембраны.
* Достоверно и однозначно определить тип хориальности с помощью УЗИ в большинстве случаев невозможно.
* 20% всех близнецов являются монохориальными, 75% из них имеют осложнения по причине нарушений плацентарного кровоснабжения. Самое грозное осложнение — фето-фетальный трансфузионный синдром.
Пренатальный ДНК-тест позволяет уже в раннем сроке — в 9−11 недель с высокой точностью определить зиготность двойни и выявить группу риска по развитию ФФТС и изменить акушерскую тактику.
Клиническое значение определения зиготности в ИПД
В случае выявления ХА по ДНК-НИПТ у близнецов, определение зиготности дает возможность определить тактику проведения инвазивного забора плодного материала.
При монозиготной двойне — достаточно одного образца хориона\плаценты\АЖ, тогда как при дизиготной двойне необходимо найти возможность достоверно получить образцы разного происхождения или при наличии ВПР и УЗ маркеров нацелиться на исследование конкретного плода.
Почему нужно проводить ДНК тест после ЭКО с ПГД
* Риск с. Дауна и нарушений числа 13, 18, Х, Y хромосом плода есть при каждой беременности.
* ПГД проводится только на 1−5 клетках.
* Пациентки программ ВРТ — группа риска по возрасту.
* Осложненный акушерско-гинекологический анамнез.
* Сохраняющая терапия влияет на уровни гормонов, поэтому БХС малоинформативен.
* Часть беременных — группа риска по невынашиванию — имеют противопоказания к ИПД.
* Высокие ожидания положительного результата при беременности ВРТ родителями.
Программы ЭКО чаще всего используют тестирование эмбриона по 1 или 5-6 клеткам различными методами. Но остается остаточный риск по причине мозаицизма и ограничению по малому количеству клеток. Поэтому выходом в данной ситуации является продолжение исследований в пренатальный период при помощи НИПТ.
Таким образом, современный алгоритм обследования плода должен включать в себя и ДНК-тест, который может быть проведен с 9 недели беременности.
Цель тестирования: каждая беременная женщина должна получить наилучшие возможности для оценки своего персонального риска хромосомных аномалий плода.
Пренатальный ДНК-тест на моногенные заболевания
По плодной ДНК детектируются мутации в 30 генах моногенных заболеваний. Суммарная частота 1:600 (выше, чем частота с. Дауна).
Выбор заболеваний
* Без семейного анамнеза.
* Высокой вероятности de novo.
* Аутосомно-доминантного и Х-сцепленного типа.
* Тяжелое клиническое состояние.
* Заболевания не выявляются при обычном скрининге.
Выводы
Тестирование плодной ДНК по высокоинформативной технологии на основе SNP
1. Позволяет с высокой точностью определять и выявлять:
* частые анеуплоидии аутосом: Т21, Т18, Т13;
* нарушения числа половых хромосом;
* частые микроделеции;
* триплоидию;
* генетический пол плода;
* зиготность близнецов.
2. Проводить исследования в группах:
* повышенного и низкого риска ХА;
* при двуплодных беременностях с определением зиготности близнецов;
* при биологически неродственном плоде (ДО или СМ).
3. Снизить количество ИПД:
* определить акушерскую тактику при беременности МЗ близнецами;
* эффективнее проводить ИПД при двуплодной беременности.
Этапное применение ДНК-тестирования — путь к здоровому ребенку
1. Преконцепционное тестирование родителей — рецессивные и Х-сцепленные генные заболевания.
2. При ВРТ — тестирование эмбрионов — анеуплоидии.
3. В первом триместре — пренатальный ДНК-скрининг: анеуплоидии, микроделеции, доминантные мутации генов de novo.
Сегодня — это детекция и исключение, а завтра — коррекция (редактирование геномов родителей/эмбрионов/плодов).
Результаты
Трансляция с конференции "NEXT GENERATION CLINIC – ШАГ НАВСТРЕЧУ БУДУЩЕМУ!"
Оцените вебинар
познавательно
Что даёт Pro подписка
Доступны 2 варианта подписки: Стандартная и Pro.
Стандартная подписка бесплатная, но возможности ее ограничены: используя ее, Вы сможете получить доступ к материалам вебинаров (видео и тезисам) только в течение 30 дней с момента их размещения.
Pro подписка – это платная подписка. Используя Pro подписку Вы Сможете получить доступ ко всем материалам, размещенным в архиве вне зависимости от срока их размещения, в любое удобное Вам время.
Мы предлагаем только актуальную информацию о передовых медицинских практиках и тщательно следим за качеством публикуемых материалов.
Вне зависимости от типа подписки онлайн конференции и вебинары остаются по-прежнему доступны всем нашим пользователям, как лучший способ поддержания профессиональных компетенций специалистов и источник самых свежих знаний, позволяющих сохранять жизнь и здоровье пациентам.
Материалы вебинаров публикуются в архиве, дабы Вы могли ознакомиться с ними, если по какой бы то ни было причине не смогли присутствовать на трансляции.
Скажите пожалуйста, почему не засчиталось присутствие? Был от начала до конца!
ответить