Резистентность микрофлоры влагалища: что нового?

Резистентность микрофлоры влагалища: что нового?

Желтикова Т.М.

Данные HMP (Human Microbiom Project, 2007)

* Человек «содержит» от 1,5 до 3 кг различных микроорганизмов (м/о).

* Выявлено до 10000 видов м/о у человека.

* Весь организм человека колонизирован одними и теми же м\о, но различные органы и системы имеют разное соотношение видов (таксонов) этих м\о. Биоценоз (БЦ) влагалища наиболее близок к БЦ пищевода.

Что нового?

* Использование молекулярно-генетических методов позволило выявить большее распространение микроорганизмов при БВ, чем традиционные методы.

* Все микроорганизмы во влагалище существуют в биоценотических отношениях друг с другом (от конкуренции до синергизма).

* До 90% бактерий при БВ существуют в биопленках.

Сравнительная характеристика клеток бактерий и дрожжевых грибов (основная особенность)

* Бактерии не имеют ядра. Генетический материал находится в нуклеоиде и плазмидах.

* В клетках грибов ядро хорошо выражено.

Структура БЦ влагалища здоровых женщин

* Более 40 видов микробов.

* Доминируют Lactobacillus – 90-97% (известно более 170 видов, в вагине — более 20 видов). В основном, это:

L. crispatus (в норме доминирует, при бактериальном вагинозе (БВ) — стремится к нулю);

L. Iners (при БВ снижается, но недостоверно);

L. jensenii;

L. gasseri;

L. vaginalis.

* Остальные 3-10%:

Gardnerella vaginalis;

Atopobium vaginaе;

Mycoplasma hominis;

Clostridiales;

Prevotella;

Leptotrichia;

Candida и многие другие.

При бактериальном вагинозе это соотношение изменяется, и 90-97% составляют условно-патогенные или факультативные анаэробы.

7-33% здоровых не имеют высокой численности лактобацилл. У них функции лактобацилл могут выполнять другие бактерии (в том числе и Atopobium vaginaе, которая может продуцировать молочную кислоту и перекись водорода).

У разных женщин соотношение м\о во влагалище отличается. Как правило, доминирует один вид лактобактерий, реже – два, еще реже – три. При этом некоторые виды лактобактерий никогда не встречаются при бактериальном вагинозе (БВ), а другие при БВ могут доминировать.

Инфекции, ассоциированные с лактобациллами (данные 19 публикаций, 2015 г.)

* L. jensenii — бактериемия, эндокардит, пиелонефрит.

* L. gasseri — бактериемия, кариес / абсцесс.

* L. rhamnosus — бактериемия, эндокардит, менингит, перитонит.

* L. acidofilus — кариес / абсцесс, эндокардит.

* L. fermentum – бактериемия, холецистит, перитонит.

Биоценотические взаимоотношения между м/о

* Конкуренция — 2 м/о не могут сосуществовать, например, лактобактерии 2-х видов: L. iners и L. gasseri или А. vaginae и L. gasseri.

* Аменсализм.

* Нейтрализм, например, G. vaginalis и A. vaginae.

* Комменсализм — одному м/о «безразлично», другому «хорошо». Один из м/о использует другой в качестве пищевого субстрата, использует его сигнальные метаболиты для того, чтобы оценивать степень опасности. Например, Prevotella bivia и G. vaginalis.

* Протокооперация, мутуализм, синергизм.

Gardnerella vaginalis

* Условно-патогенный м/о.

* Обладает наибольшей адгезивностью, в т. ч. и к слизистой влагалища, и цитотоксичностью по сравнению с др. бактериями.

* Формирует более толстую биопленку, чем другие анаэробы. Образует своего рода каркас, к которому прикрепляются другие м\о.

* Выявлен и у здоровых женщин.

* Разные штаммы имеют различную вирулентность, способность образовывать биопленки.

* «Рассеянный», планктонный штамм Gardnerella встречается у здоровых женщин без БВ.

* «Сцепленный» адгезивный штамм Gardnerella (образование биопленки) — сигнал о нарушении БЦ влагалища, выявляется у женщин с БВ.

Gardnerella vaginalis и лактобациллы in vitro (результаты исследований)

* Планктонный штамм Gardnerella vaginalis хорошо «уживался» с L. crispatus (нейтрализм).

* Планктонный штамм Gardnerella vaginalis + L. iners = нейтрализм.

* L. crispatus уменьшал адгезию штамма Gardnerella vaginalis, взятого из биопленки (конкуренция).

* L. iners усиливал адгезию штамма Gardnerella vaginalis, взятого из биопленки (комменсализм).

Таким образом, сделан вывод о том, что присутствие L. crispatus ассоциировано с редкими эпизодами БВ. И, наоборот, L. iners является маркером нарушения БЦ влагалища, его присутствие связано с более частыми эпизодами БВ.

Atopobium vaginaе

* Высокоспецифичный маркер БВ.

* В мазке маскируется под лактобациллы.

* Грам (+) м/о из семейства Corinobacteriaceae.

* У женщин с БВ в разных популяциях Atopobium vaginaе выделяется до 95%.

* У здоровых женщин выделяется Atopobium vaginaе в 8-15% в разных популяциях.

Скрининговая программа «Национальный проект по Atopobium vaginaе»

* Данные обследования 637 женщин с БВ в РФ: у 32% выделен A. vaginaе, у остальных 68% - он не обнаружен.

* По данным литературы в различных популяциях показатель выявления A. vaginaе при БВ достигает 95%, у здоровых женщин — 8-15%.

Синергизм между A. Vaginaе и Gardnerella vaginalis

* A. Vaginaе и Gardnerella vaginalis прекрасно сосуществуют вместе.

* A. Vaginaе, как правило, выделяют с Gardnerella vaginalis.

* Gardnerella vaginalis в биопленке может быть без A. Vaginaе.

Частота выделения A. Vaginaе и Gardnerella vaginalis у женщин с выделениями из влагалища и их связь с БВ (Российское исследование)

* У женщин с БВ в 80% случаев.

* У женщин с промежуточным типом вагинального биоценоза – 48%.

* У женщин с нормоценозом – 27%.

Изолированно один из этих видов выделялся преимущественно у женщин с нормоценозом и промежуточным биоценозом, и крайне редко обнаруживался при БВ.

Был сделан вывод о том, что одновременное выделение A. Vaginaе и Gardnerella vaginalis ассоциировано с более частыми эпизодами БВ, резистентными к лечению.

Резистентность – комплекс защитных механизмов

* Первичная, видовая устойчивость – препарат не действует (отсутствие мишени). Например, флуконазол не действует на C. kruzei, а метронидазол на A. vaginae.

* Приобретенная устойчивость – свойство отдельных штаммов сохранять жизнеспособность при тех концентрациях антибиотиков, которые подавляют основную часть микробной популяции.

Резистентность – это предотвращение взаимодействия антибиотика с его мишенью (за счет изменения самих мишеней, или с помощью синтеза ферментов, нейтрализующих антибиотики).

Толерантность – способность микробной клетки выживать в присутствии антибиотика за счет замедления метаболизма и «выключения» основных биологических процессов (клетки-персистеры).

Перекрестная резистентность – устойчивость клетки или организма к нескольким различным внешним агентам, даже к тем, которые ранее никогда не действовали на эту клетку, в результате изменения одного генетического фактора.

Причины резистентности

* Генные мутации.

* Изменение физиологических параметров популяции (в синтезе белков-ферментов, повышение устойчивости мишени, ускорение процессов метаболизма, эффлюкс-помпа и т.д.).

* Формирование биопленок.

Биопленка

Биопленка — это микробное сообщество, клетки которого прикреплены к поверхности и/или друг к другу, погружены в матрикс синтезированных ими внеклеточных полимерных веществ. Они демонстрируют изменение фенотипа, выражающееся в изменении параметров роста и экспрессии специфичности генов.

Бактерии в биопленке живут в тесной связи друг с другом. Они защищены, поскольку находятся в собственной среде, «оповещают» друг друга об опасности, способны передавать м/о других видов генетическую информацию в виде материального субстрата — плазмидов, таким образом, давая толчок к мутациям.

Стадии развития биопленки

1. Первичное (обратимое) прикрепление м/о к поверхности (адгезия).

2. Окончательное (необратимое) прикрепление — фиксация.

3. Созревание.

4. Рост.

5. Дисперсия — расселение м/о (выброс бактерий).

Факторы резистентности биопленок

* Высокая плотность клеток.

* Внеклеточный матрикс (бета-глюканы, внеклеточная ДНК и др.).

* Замедленный метаболизм клеток.

* «Чувство кворума» (Quorum sensing) – процесс коллективной координации экспрессии генов.

* Формирование клеток-персистеров. Это метаболически неактивные клетки, которые не погибают от воздействия антибиотика (поскольку не питаются и не активны) и являются источником рецидива после терапии. Доля клеток-персистеров в биопленках – 1-5%.

* Swarming (роение) – движение м\о по поверхности или в толще субстрата по типу роения.

Методы изучения / диагностики биопленок

Применяются преимущественно в научной практике

Динамические, с использованием лабораторных ферментов (в культиваторах создаются условия, близкие к кишечнику, влагалищу).

Статические, с использованием пластиковых планшет. Более легкий метод.

Современные технологии (дорогие методы, требующие высокой квалификации персонала):

* измерение биолюминисценции (BPI);

* электронная микроскопия и конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM);

* метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH).

Ключевые клетки

«Ключевые клетки» при БВ — это клетки плоского эпителия влагалища с адгезированными на них м/о.

Экологические преимущества биопленок

* Метаболическая кооперация: облегчение доступа питательных веществ, обмена генетической информацией, замедление метаболизма и скорости роста.

* Защита от негативных воздействий окружающей среды, в том числе и антибактериальных препаратов.

* Резистентность к антибактериальным агентам, затруднение проникновения антибиотиков, их инактивация полимерами или ферментами внеклеточного матрикса.

Биопленки – причина рецидивов БВ

Одной из причин рецидивов БВ – это формирование биопленок несколькими видами бактерий. В составе пленок в 27-75% случаев обнаруживается atopobium vaginae (A.v.) и в 80-100% случаев G. Vaginalis. Более 90% биопленок образованы сочетанием A.v. и G.v. Риск рецидива при сочетании этих двух бактерий – 83% и 38% при монокультуре.

Особенности «биопленочного» БВ

* Затяжное течение процесса и склонность к хронизации.

* Повышенная вероятность диссеминации возбудителя, приводящая к генерализации процесса.

* Продукция эндотоксина, что может привести к развитию инфекционно-токсического шока.

* Неэффективность традиционной а/б терапии. Бактерии в биопленках могут обмениваться плазмидами резистентности (передача резистентности от вида к виду).

* Бактерии в биопленках не поддаются воздействию иммунной системы человека (например, фагоцитозу).

Дифференциальная диагностика БВ и вульвовагинального кандидоза (ВВК)

* рН вагинальной среды: при БВ более 4,5; при ВВК – любая.

* Микроскопия выделений с боковой стенки влагалища в физиологическом растворе: при БВ – ключевые клетки (95%); при ВВК – псевдогифы (40-60%), бластоспоры (добавление КОН к влажному мазку лизирует эпителиальные клетки, что может сделать гифы более заметными).

* Окрашивание выделений с боковой стенки влагалища по Грамму: при БВ – см. критерии Ньюджента; При ВВК – споры\псевдогифы (65% или более случаев с симптомами).

* Тест Whiff – появление рыбного запах при добавлении щелочи (10% КОН): при БВ – положительный результат; при ВВК – отрицательный.

Отличия аэробного (неспецифического) вагинита от БВ

Аэробный вагинит отличается отсутствием специфического запаха, отрицательным тестом КОН, лейкоцитозом, рН более 6,5 и отсутствием ключевых клеток. Также основные м\о – это Streptococcus spp., Staphylococcus spp.

Лечение БВ

Клиндамицин эффективен в отношении A. vaginae (устойчива к метронидазолу) и аэробной микрофлоры.

Метронидазол эффективен в отношении факультативно-анаэробных бактерий, простейших и аэробных бактерий.

Эффективность клиндамицина при рецидивирующем БВ

* Клиндамицин более эффективен, чем метронидазол в лечении БВ, ассоциированного с A. vaginae.

* Эффективность клиндамицина (2% вагинальный крем 5 г на ночь 6 дней) – 83,3%.

* Эффективность метронидазола (0,75% вагинальный крем 5 г на ночь 5 дней) – 33,3%.

Вульвовагинальный кандидоз (ВВК)

Революция 2011 года: Candida — это не Candida!!!

Candida albicans в научном мире переименована в Lodderamyces albicans!

В данный момент видами из рода Candida пока еще считают:

* Candida glabrata;

* Candida sake;

* Candida pimensis.

В род Lodderamyces выделены:

* Lodderamyces albicans;

* Lodderamyces parapsilosis;

* Lodderamyces tropicalis;

* Lodderamyces maltosa.

Новые виды Candida

* Candida africana, Candida dubliniensis – C. albicans.

* Candida nivariensis, Candida bracarensis – C. glabrata.

Данное изменение не влияет на протоколы лечения.

Механизм действия флуконазола на клетки дрожжей

Флуконазол воздействует на 14-α-деметилазу, которая принимает участие в синтезе ланостерола и эргостерола, которые составляют клеточную стенку гриба. Разрушение стенки делает клетку восприимчивой к антимикотикам и собственным защитным механизмам влагалища.

Используемые методы определения чувствительности м\о к антибактериальным препаратам отражены в методических указаниях 4.2.1890-04. Это: метод серийных разведений и диско-диффузионный метод, которые включают в себя международные стандарты.

Трудности определения чувствительности грибов к антимикотикам

* Чувствительность in vitro не всегда отражает чувствительность in vivo – синергизм флуконазола и органических кислот (например, ацетиловой) в норме присутствующих во влагалище.

* Методы определения чувствительности.

На сегодня доступен тест, соответствующий отечественным и международным рекомендациям на определение чувствительности дрожжей к различным антимикотикам (5-флюороцитизин, амфотерицин В, миконазол, кетоканазол, интраконазол, флуконазол). Он прост в использовании и интерпретации (при наличии роста грибов, изменяется цвет ячейки со средой).

Резистентность дрожжевых грибов к а/б (ARTEMIS DISK 1997-2007 гг., 256882 изолята дрожжей из 142 клиник, 41 страны)

* Частота выявления устойчивых штаммов грибов Candida зависит от их вида и от антимикотика. Так, например, у c. albicans устойчивость к флуконазолу всего 2-4%, тогда как у c. kruzei – 91% к флуконазолу! Если сравнивать такие антимикотики как флуконазол и вориконазол, устойчивость c. albicans невысока – 1,2 – 1,4%, тогда как у c. kruzei – устойчивость к флуконазолу – 42%, к вориконазолу – 8%. Также с. glabrata в меньшей степени устойчива к флуконазолу по сравнению с итраконазолом.

* Частота выявления устойчивых штаммов Candida изменяется год от года в разных странах / городах и даже лечебных учреждениях (чаще в онкоцентрах).

* Частота выявления устойчивых штаммов Candida варьирует в зависимости от локализации в организме (так во влагалище гораздо меньше резистентных видов, по сравнению с желчевыводящими путями).

Вопросы

Можно ли при помощи обычных лабораторных анализов определить биопленочный БВ?

Такие методы существуют, но согласно регламентирующим документам, 90% и более случаев ВВК и БВ протекают по типу биопленочных, поэтому выявление биопленки не требуется и лечение проводится соответствующее.

С чем связаны отличия в резистентности между флуконазолом и вориконазолом в разных странах?

От покупательской способности в отношении того или иного препарата, длительности использования и популярности препарата, состава популяции (генетических особенностей). Важно помнить, что резистентность — это не константа и она может меняться с течением времени.

Чем объясняется снижение резистентности к антимикотикам в ряде стран, например, Чехии?

Они заменили один препарат другим (ротация), и со временем восстановилась чувствительность к первому.

Какие препараты можно назначать для разрушения биопленок?

In vitro – антисептики.

Какую роль играет уреаплазма в биоценозе влагалища?

Уреаплазма выделяется как во влагалище у здоровых женщин, так и у пациенток с БВ. На сегодня невозможно определить какого-либо одного возбудителя БВ.

Дрожжи и мицелий в мазках – существуют ли различия в лечении?

Нет, лечение одинаковое.

Всегда ли нужно определять чувствительность при ВВК или можно назначить эмпирическое лечение?

Нет, в регламентирующих документах не рекомендуется определение чувствительности. Только в случае рецидивирующего течения и устойчивости к эмпирическому лечению.

Как интерпретировать наличие кокков в мазках и менее 20 лейкоцитов?

В первую очередь следует ориентироваться на клинику. Если женщину ничего не беспокоит, лечения не требуется. У здоровой женщины может определяться разнообразная условно-патогенная флора.

Нужно ли лечение при наличии спор грибов в мазках без клиники?

Нет, только при наличии клинической картины.

Как интерпретировать наличие в мазках преимущественно лептотрикса?

Роль лептотрикса в развитии БВ пока не определена и только начинает изучаться, поэтому ориентироваться на клиническую картину.