Метод NGS на сегодня постепенно вытесняет aCGH, поскольку имеет целый ряд преимуществ, и в первую очередь – более высокую точность. Об этих преимуществах и возможностях технологии NGS и идет речь в этом материале. В нем предоставлены данные собственного исследования и данные различных авторов о частоте патологии эмбрионов при ПГД в различных возрастных группах, частоте мозаицизма и более достоверном методе его диагностики, а также о факторах способных повлиять на результаты исследования. Особое внимание уделяется алгоритму проведения ПГД и этапам NGS
ВЕБИНАР СЛЕДУЮЩИЙ
ВЕБИНАР
Тезисы
Применение метода NGS для выявления анеуплоидий у преимплантационных эмбрионов
Глинкина Ж.И.
Основные показания для ПГД
* Пары у которых в анамнезе были случаи рождения детей с наследственной и врожденной патологией.
* Пары, в кариотипе которых имеются сбалансированные хромосомные аберрации.
* Возраст старше 35 лет.
* 2 и более неудачных попыток ЭКО в анамнезе.
* Случаи пузырного заноса и невынашивания беременности в анамнезе.
* Мужской фактор бесплодия.
Проведение ПГД позволяет родить здорового ребенка, снижает репродуктивные потери в разы, решает вопрос о донорских клетках и о суррогатном материнстве.
Используемые сегодня методы: NGS (секвенирование) и CGH (геномная гибридизация).
Преимущества NGS
* Не требуются референсные образцы, линейная шкала копийности хромосом вместо логарифмической при 24sure.
* Проводится определение последовательности нуклеиновых кислот.
* Полученные данные представлены с более «низким шумом» по сравнению с 24sure.
* Более точно представлены частичные делеции, дупликации, мозаицизм.
Самый простой в работе – это секвенатор MiSeq Illumina. Состоит из трех отделений для ячейки с образцами, картриджа и емкостей с промывочным буфером. Продолжительность секвенирования 24 образцов около 6 часов.
В отличие от CGH, NGS точно определяет мозаицизм и в последнее время эта технология вся больше вытесняет метод CGH.
Основные этапы NGS
1. Выделение, получение фрагментов определенной длины ДНК.
2. Прикрепление адаптеров по краям фрагментов, индексов.
3. Амплификация каждого фрагмента ДНК; определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК.
4. Биоформатический анализ данных.
Что может повлиять на результат?
* Проведение биопсии (какие клетки получены, как получены, насколько повреждены).
* Низкое качество исходной ДНК (деградация и другие процессы в ДНК дают шум при секвенировании).
* Ошибки проведения WGA.
* Ошибки в подготовке библиотеки.
NGS хорошо визуализирует анеуплоидии, дупликации и мозаицизм, легко для интерпретации (шкала ХУ, где – Х – все хромосомы от 1 до ХУ, а ось У – количество копий). Сложно написано и Х хромосома и шкала Х. Думаю это не обязательно
Исследование
Было проанализировано 1571 эмбрионов от 631 женщины (средний возраст 37,5 лет). Все эмбрионы были получены оплодотворением методом ИКСИ. В исследование были взяты пары с нормальным кариотипом.
Генетическая патология была выявлена у 61,7%.
Частота патологии эмбрионов в разных возрастных группах
* До 35 лет – 54,3%.
* 35-40 лет – 61,8%.
* Старше 40 лет – 75,0%.
У женщин моложе 35 лет чаще всего обнаруживаются патологические изменения в одной хромосоме, тогда как у женщин старше 40 лет чаще встречается сочетанная патология с вовлечением нескольких хромосом.
Чаще всего хромосомная патология встречается в 15,16, 21, 22 хромосомах.
У женщин младше 40 лет чаще встречаются делеции, дупликации, мозаицизм, тогда как у женщин старше 40 лет – чаще трисомии.
Частота отмены переноса после ПГС: у женщин до 35 лет – 15,7%, у женщин старше 40 лет – 65,9%.
Всего было 94 переноса, 55 клинических беременностей. Наступление беременности – 58,5%.
Данные этого исследования коррелируют с данными других авторов.
Мозаицизм
Частота мозаицизма в эмбрионах по данным различных авторов колеблется от 4 до 70%. Такой разброс, вероятно, связан с тем, что до определенного времени отсутствовали четкие критерии какой процент мозаицизма считать нормой, какой патологичным.
По результатам 18 переносов мозаичных эмбрионов (моносомии), наступило всего 6 беременностей. В остальных случаях беременность не наступала или диагностировалась биохимическая беременность.
Выводы: при переносе мозаичного эмбриона можно добиться рождения здорового ребенка, но важно учитывать, что мозаицизм влияет на вероятность имплантации и риски прерывания беременности.
При помощи NGS можно уловить 20% и даже меньше в эмбрионе.
Был проведен ретроспективный анализ 21 выкидыша после ПГС при помощи aCGH. Повторное исследование было проведено методом NGS и у 9 из этих эмбрионов (43%) были обнаружены небольшие хромосомные нарушения (мозаицизм, делеции, дупликации), что еще раз доказывает более высокую точность метода. Выявление данной патологии требует новых подходов к консультированию пациентов клиническим генетиком. Врач должен знать роль тех или иных обнаруженных вариаций в биологических процессах, свободно владеть базами данных, в которых собрана информация о значении генетических изменений (существует несколько баз).
Позиция PGDIS о хромосомном мозаицизме и анеуплоидии на стадии бластоцисты
* Для определения мозаицизма идеально должно быть прибиопсировано 5 клеток.
* Эмбрионы с мозаицизмом до 20% считать нормальными, 80% - с анеуплоидией.
* Мозаицизм от 20 до 80% требует консультации клинического генетика.
* Пациенты, которым будут перенесны эмбрионы с мозаицизмом, должны быть предупреждены о всех рисках (отсутствие наступления беременности, выкидышах и т.д.).
* Пациентам, у которых наступила беременность в результате переноса эмбрионов с мозаицизмом, рекомендуют: мониторинг и пренатальную диагностику (предпочтительно амниоцентез).
Порядок выбора предпочтения переноса эмбрионов с мозаицизмом
* Предпочтение отдается эмбрионам с эуплоидией\моносомией, чем эмбрионам с эуплоидией\трисомией, поскольку при наличии моносомии у плода, он будет нежизнеспособным, тогда как трисомия может дать рождение больного ребенка.
* С трисомией порядок переноса по хромосомам: 1, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 17, 19, 20, 22, Х, У.
* Эмбрионы мозаики трисомии по хромосомам 14, 15 переносить в крайних случаях (потенциально могут давать однородительские дисомии).
* Эмбрионы мозаики трисомии по хромосомам 2, 7, 16 переносить в крайних случаях (потенциально могут давать неразвивающиеся беременности).
* Эмбрионы мозаики трисомии по хромосомам 13, 18, 21 по понятным причинам переносить в самых крайних случаях!!!
Транслокации
Компания Illumina не рекомендует диагностировать транслокации методом NGS, поскольку он не является столь чувствительным в определении мелких перестроек, однако, по данным собственных наблюдений, результаты NGS по транслокациям полностью совпадают с данными ПЦР. Но важно помнить, что при наличии транслокаций очень высока вероятность обнаружения анеуплоидий по другим хромосомам.
На сегодня пока обсуждается более предпочтительный метод диагностики транслокаций.
Исследование клеток неразвивающегося хориона
Методика хорошо отлажена и NGS также имеет целый ряд преимуществ.
Расшифровка результатов секвенирования
Seq (1-22)x2, (XY)x1 Численных хромосомных нарушений не обнаружено. Хромосомный набор соответствует нормальному мужскому кариотипу (Seq – секвенирование, (1-22)х2 – исследованы хромосомы с 1 по 22, всех хромосом по 2, (ХУ)х1 – половых хромосом по одной).
Seq (1-22, X)x2 – численных хромосомных нарушений не обнаружено. Хромосомный набор соответствует нормальному женскому кариотипу.
Seq (13)x1, (XY)x1 – моносомия по 13 хромосоме, аномалий числа половых хромосом не обнаружено. Патологии остальных хромосом не обнаружено.
Seq (8)x3, (XY)x1 – Трисомия по 8 хромосоме, аномалий числа половых хромосом не обнаружено. Патологии остальных хромосом не обнаружено.
Seq (4)x1⸟2, (XY)x1 – результат анализа предполагает наличие мозаицизма по хромосоме 4.
Seq (9)x2⸟3, (XY)x1 - результат анализа предполагает наличие мозаицизма по хромосоме 9.
Seq (17q11.2 -˃ 17q25.3)x1⸟2, (XY)x1 – наличие мозаицизма в указанном участке.
При наличии сочетанных патологий, они все перечисляются.
Алгоритм проведения ПГД у пациентов с генетической патологией
Моногенные заболевания – всегда QF-PCR.
1. Всегда необходимо знать мутацию, консультация клинического генетика.
2. Подготовительный этап обязательно с подбором маркеров (супруги + ребенок\дети если есть).
3. Желательно ПГС на распространенные анеуплоидии (по меньшей мере еще 5 хромосом).
Наличие в кариотипе сбалансированных транслокаций
1. Робертсоновские транслокации – метод NGS, подготовительный этап не нужен. Кариотип 45, ХХ, der(13;14) (q10;q10).
2. Реципрокные транслокации: связаться с лабораторией! Если участки большие – метод NGS, подготовительный этап не нужен. Если участки маленькие - QF-PCR, подготовительный этап нужен.
Вопросы
Как можно отправить материал для исследования?
В Москве можно привезти в физрастворе (ткань неразвивающегося хориона после выскабливания). Если исследование было проведено в конце рабочей недели, материал хранится в физрастворе при температуре +4, и после выходных доставляется в лабораторию. Стоимость 30 000 рублей.
Для доставки из регионов – хорион подсушивается на салфетке, помещается в эппендорф, замораживается и при температуре +4 доставляется курьером.
Для доставки из отдаленных регионов – хорион можно высушить на салфетке и отправить в конверте.
Для транспортировки клеток трофэктодермы мы обеспечиваем эппендорфами с буфером, которые также доставляются курьером обратно в лабораторию при +4 (стоимость 35 000 рублей).
Приблизительная площадь для оборудования лаборатории?
Около 7-8 комнат общей площадью 150 метров.
Буферы для NGS и ПЦР различаются?
Буферы разные, и путать их нельзя.
Почему результаты в разных лабораториях могут отличаться?
Если в разные лаборатории были отправлены разные части одного эмбриона, это закономерно, поскольку мозаицизм – это биологический феномен и результат будет зависеть от того, какие клетки были отправлены на исследование.
Уважаемые коллеги, данная лекция не подавалась на аккредитацию и проводилась в рамках повышения знаний.
ответить