История и практика применения неинвазивного пренатального теста в России
Реальные возможности и проблемы внедрения пренатального неинвазивного скрининга хромосомной патологии в России
Прохорчук Е.Б.
Первые шаги
Первые попытки выделения трофобластов (экстраэмбриональные клетки плода) в крови матери были предприняты в начале 90-х годов.
Трофобласты имеют больший размер по сравнению с клетками крови + на их поверхности обнаруживаются определенные маркеры. Эти особенности использовались в попытках выделения трофобластов: применялись специальные фильтры, чтобы отфильтровать их по размеру, иммунологические ловушки по маркерам, но все эти многочисленные работы не приводили к желаемому результату вплоть до 2001 года.
ДНК плода
При гибели трофобластов, фрагменты их ДНК (а значит плода) продолжают циркулировать в крови матери. Также в крови матери циркулируют ее фрагменты ДНК, которые остаются после разрушения форменных элементов крови. Поэтому в последующем стали определять ДНК плода в крови матери, количество которого растет с увеличением срока беременности.
Секвенирование
Так как отсутствуют какие-либо маркеры, позволяющие отличить ДНК плода и ДНК матери, изначально стало применяться секвенирование (чтение) без отбора. Принцип метода: учет количества чтений, которые картируются на 21 хромосому. Учитывая то, что на 10 неделе количество ДНК плода составляет 10%, а матери 90%, и у матери нормальный кариотип, рассчитывается соответствующий коэффициент нормы и трисомии для плодовой ДНК.
Геном человека состоит из последовательности 3 млд. букв, состоящих из 4-х букв. Данная методика не может читать большие последовательности, а лишь участки по 50 букв случайным образом. Если провести аналогию с текстом, то это чтение коротких фраз в пределах одного абзаца, страницы и т.д. Полученная информация об одном из прочитанных участков, сравнивается с референсными таблицами и относится к тому или иному участку гена. Таким образом, если одинаковая информация по какой-либо хромосоме поступает повторно, мы можем сделать вывод о трисомии.
Чувствительность и специфичность метода
Метод дает возможность определять следующие патологии
* Трисомия 21, 13 и 18 хромосом.
* Моносомия Х.
* Дисомия Х.
* Трисомия Х.
* Дисомия Y.
Чувствительность метода для трисомии 21 составляет 99,7%, а специфичность 99,9%.
Данные подтверждены исследованиями в нашей лаборатории (более 1000 образцов).
Теоретически метод позволяет определять микроделеционные синдромы и моногенные заболевания, однако, это пока сопряжено с техническими сложностями, высокой стоимостью и еще не вошло в широкую практику.
В 2016 году в США и Канаде уже проведено около 1 000 000 тестов NGS, в Европе и Китае по 400 000.
Средняя стоимость теста – около 1000 долларов (в зависимости от страны).
Тесты в России
Проведение тестов в России осуществляется только у двух центров: НЦАГиП им. ак. В.И. Кулакова и компании ГЕНОАНАЛИТИКА в сотрудничестве с МГУ.
Проблема заключается в полном отсутствии нормативной базы и методических указаний Минздрава. Врачи не очень хорошо понимают, когда и как назначать проведение этого теста.
Поэтому производители создали своего рода методические указания по проведению пренатального скрининга хромосомной патологии, которые были опубликованы в журнале «Акушерство и гинекология» в августе, 2016г.
Основные тренды
* Удешевление методики за счет увеличения потока образцов.
* Введение НИПТ в качестве скрининговой диагностики.
* Инвазивная диагностика, как обязательный тест при доказательстве диагноза, выявленного по НИПТ.
Как должно быть
* Консультация пациента, решение вопроса о необходимости проведения НИПТ по показаниям.
* Забор крови в специальные пробирки и контейнеры, предоставленные лабораторией. В них кровь может храниться при комнатной температуре, при этом форменные элементы крови матери разрушаться не будут, увеличивая количество материнской ДНК.
* Логистика образцов крови в лабораторию. Пока единственная лаборатория находится в Москве.
* Загрузка образцов в установку и их анализ. Оценка и анализ результатов проводится по базе образцов, загруженных в аппарат (сравнивает по базе здоровые и нездоровые образцы с кровью пациентки). В первые несколько лет аппарат обучался и на данном этапе самообучается на каждом новом исследовании. Таким образом, чем больше исследований, тем точнее результат.
* Получение результатов тестирования врачом (около 10 дней от момента забора). При положительном тесте, рекомендации по инвазивной диагностике.
Обратная связь врач-лаборатория (создание базы данных)
Информация от врача для лаборатории
* Индекс массы тела, возраст и т.д.
* Причина, по которой пациентке назначен НИПТ.
* В случае обнаружения анеуплоидии – кариотип по результатам инвазивного исследования.
* При рождении ребенка с хромосомной аномалией – результаты молекулярного кариотипирования.
Информация от лаборатории врачу
* Концентрация свободно циркулирующей ДНК плода. Если концентрация плодовой ДНК низка, результат можно признать недействительным.
* Должны быть доступны лабораторные метрики.
* Результаты исследования. Вероятности генетических аномалий.
Что может помешать внедрению НИПТ в России
* Аппаратное решение. Согласятся ли производители предоставлять свое оборудование и реактивы для производства НИПТ в России?
* Качество программного обеспечения (необходима большая референсная популяция): базы данных «Врач-Лаборатория», проведение клинических испытаний.
* Нормативная документация. Методические указания. Регистрационные удостоверения на оборудование, реактивы, программное обеспечение.
* Срок проведения анализа – максимально быстро. Это зависит от потока образцов и возможностей аппаратно-программного комплекса.
* Логистика образцов. Доставка из отдаленных районов страны.
Основные проблемы
* Работа с частными клиниками. Часто тест назначается не по показаниям, а из экономической заинтересованности врача или клиники.
* Работа с государственными центрами – низкая информированность врачей и налаживание обратной связи с врачом.
* Кто несет ответственность в случае ложноотрицательной ошибки?! Каков правовой статус теста?
* Этическая проблема в случае определения пола плода до 12 недели (когда женщина сама может принимать решение о прерывании беременности, в том числе при нежелательном поле плода).
Недавно журнал the NEW ENGLAND JOURNAL of MEDICINE опубликовал данные о том, что не все компании по НИПТ честны с пациентками – реальная частота ложноположительных и ложноотрицательных результатов значимо выше, заявленной в рекламе.
Причины ошибок НИПТ
* Мозаицизм – 1%. В случае аномального кариотипа трофобласта и нормального кариотипа плода будет получен ложноположительный результат (ЛП), и наоборот, при нормальном трофобласте, но аномальном плоде, будет получен ложноотрицательный (ЛО) сигнал.
* 69 хромосом (ЛО) – менее 0,1%.
* Проблемы у матери. Онкологическое заболевание (ЛП) – 0,1%.
* Низкая концентрация плодового ДНК (ЛО) – 5%
* Предыдущая беременность (ЛП) - ?
* Слишком большой ИМТ (ЛО) – 0,5%.
* Техническая (ЛП и ЛО) 0,1-1%.
Очевидно, что существует необходимость создания дешевого отечественного секвенатора и проведения клинических испытаний, а также решения этических проблем и вопроса внедрения НИПТ в ОМС.
Вопросы
Пройдена ли сертификация ваших реактивов? Если нет, то как мы можем выдавать результаты исследований пациенткам? Геномед или Геноаналитика работают на несертифицированных реагентах.
Все реагенты, ввозящиеся на территорию РФ проходят сертификацию. В нашей лаборатории имеют регистрационное удостоверение Минздрава и аппаратура и программное обеспечение, и реагенты. Геномед не проводит исследования на территории страны, а вывозит образцы в США. Какие реагенты используются там, необходимо поинтересоваться в компании Геномед.
Проблема как раз заключается в том, что существуют приборы и реактивы, способные существенно удешевить тестирование, однако, они не зарегистрированы и мы не можем их использовать.
Интересное изложение, приятно слушать
ответить