Возможности молекулярного кариотипирования в педиатрической практике

Воинова В.Ю.

Молекулярное кариотипирование (МК) (как и экзомное секвенирование) относится к полногеномным исследованиям. Это увеличивает возможности благодаря высокому разрешению и полногеномному анализу, однако создает ряд проблем, которые необходимо решать (например, сложно вычленить нарушения, характерные именно для конкретного пациента при данной патологии). Поэтому важно использовать различные методы исследования в комплексе, но возможности МК неоспоримы.

Открытие новых рекуррентных синдромов (заболевания, нередко встречающиеся в практике, но с неизвестной основой до появления МК)

Пример: синдром микродупликации Хq28, включающий ген МЕСР2. Это 1% всех детей с нарушениями интеллекта. Фенотип: задержка психомоторного и речевого развития, частые респираторные инфекции, крипторхизм, микробрахицефалея, широкое лицо, эпикант, гипоплазия средней части лица, заостренный нос, маленький полуоткрытый рот, крупные низко расположенные ушные раковины.

Синдромы реципрокных микроделеций\микродупликаций

Многие микроделеционные синдромы были известны еще до открытия метода МК: с. Вильямса, с. Смита-Мажениса, с. Прадера-Вилли\Ангельмана, с. Миллера-Дикера, с. Ди Джоржи. После появления МК было обнаружено, что эти микроделеционные синдромы имеют свои реципрокные микродупликационные синдромы – «зеркальное отражение» синдрома в тех же самых участках генов.

Механизм формирования этих синдромов заключается в неаллельной гомологичной рекомбинации – когда происходит неправильное спаривание идентичных участков хромосом в мейозе (процесс формирования половой хромосомы) и одна хромосома получает микроделецию (-1 участок), а вторая микродупликацию (+1 участок).

Клинически микродупликационные синдромы выражены не так ярко.

Примеры

С. Смита-Мажениса (ОМIМ 182290) – микроделеция.

Фенотип: низкий рост, ЗПРР, нарушения сна (частые пробуждения ночью, раннее просыпание, дневная сонливость), импульсивность, агрессия, аутоагрессия, гипотония мышц, походка на широкой основе, низкий хриплый голос, МАР (выпуклый лоб, монголоидный разрез глаз, гипоплазия средней трети лица, короткий нос с открытыми вперед ноздрями, верхняя губа в форме «шатра», маленькие кисти и стопы, брахидактилия).

С. Потоки-Лупски (OMIM 610883) – зеркальный микродупликационный синдром.

Фенотип: низкий рост, ЗПРР, расстройство аутистического спектра, гипотония мышц, открытое овальное окно, гиподонтия, выступающие лобные бугры, гипоплазия нижней челюсти.

Обратное фенотипирование

Обратное фенотипирование – это изучение фенотипа детей со схожими генетическими изменениями, а не наоборот, когда велся поиск идентичных генетических нарушений у детей, схожих фенотипически. Таким образом, удалось открыть новые редкие синдромы.

Пример

Синдром делеции 1р32.1-р31.1. Описано всего 7 таких детей.

Фенотип: задержка психомоторного развития, лицевые микроаномалии: выступающий лоб, эпикант, седловидный нос, маленькие рот и подбородок, низко расположенные диспластичные ушные раковины, дефект межжелудочковой перегородки, агенезия мозолистого тела на МРТ, гипоспадия, удвоение дистальных фаланг первых пальцев стоп.

Открытие этиологии ранее описанных синдромов

Микроделеционный с. Вильямса (OMIM 194050) и его зеркальный микродупликационный синдром 7q11.23 (OMIM 609757)

Фенотип с. Вильямса описан еще в 1961 году, а генетическая основа открыта лишь в 1993 году. Его микродупликационный синдром открыт с появлением молекулярного кариотипирования.

Фенотип с. Вильямса (с. «лица эльфа»): выступающие низко опущенные щеки; вздернутый нос с открытыми вперед ноздрями; эпикант; крупный рот с толстыми вывернутыми наружу губами; очень общительны, но общение поверхностное; отстают в умственном развитии, но очень хорошо усваивают речь на слух, музыкальны; хрипловатый низкий голос; покатые, немного опущенные плечи; стеноз легочной артерии или аорты; звездчатая (зернистая) радужка.

Его реципрокный микродупликационный синдром более мягкий. Фенотипически дети обычные, с с. Вильямса их объединяет низкий интеллект.

Синдром субтеломерной микроделеции 9q34.3 (Kleefstra syndrome, OMIM 610253)

Фенотипически был описан гораздо раньше получения результатов МК.

Фенотип: задержка психического развития; аутистические черты в поведении; гипотония мышц, особенности лица (микробрахицефалия, синофриз, гипоплазия средней части лица, открытые вперед ноздри, вывернутые губы); аномалии строения мозга – корковая лобная атрофия, вентрикуломегалия; врожденный порок сердца – клапанный стеноз аорты, двустворчатый аортальный клапан, клапанный стеноз легочной артерии.

Более 85% случаев заболевания – микроделеция 9q34.3, но всегда затрагивает ген ЕНМТ 1. И лишь менее 15% случаев заболевания обусловлены точковыми мутациями в гене ЕНМТ1.

С. Питта-Хопкинса (OMIM 610954) – микроделеционный синдром

Синдром клинически описан в 1978 году. Микроделеция 18q21.2 – 2 случая описаны в 2007 году. В этом же году обнаружен ген TCF4 в этой хромосоме (критический для данного заболевания), его точковые мутации приводят к развитию заболевания.

Фенотип: умственная отсталость; судороги; приступы гипервентиляции; хронические запоры (б-нь Гиршпрунга); специфическое лицо (выступающие надбровные дуги, широкий уплощенный нос, большой рот с изогнутой верхней губой).

У одного и того же пациента может присутствовать несколько генетических мутаций, утяжеляющих фенотипические проявления.

Диагностика моногенных заболеваний

Микроделеции, ключевые симптомы которых – результат гаплонедостаточности одного гена

С. Моуат-Вильсона, OMIM 235730

Синдром клинически описан в 1998 году. Описаны более 180 случаев точковых мутаций в гене ZEB2.

Был диагностирован 1 случай заболевания, когда обнаружилась микроделеция 2q22 целиком, затронувшая и соседние участки, а клинически она себя проявила, как и точковые мутации в гене ZEB2.

Фенотип: умственная отсталость, микроцефалия, эпилепсия, низкий рост, врожденные аномалии сердца, б-нь Гиршпрунга, агенезия мозолистого тела на МРТ, характерное лицо (гипертелоризм, сходящееся косоглазие, закругленный кончик носа, широкая носовая перегородка, постоянно открытый рот, заостренный подбородок, ротированные назад ушные раковины).

Синдром Ретта

Фенотип: до 1-1,5 лет дети растут и развиваются нормально, затем возникает регресс высших корковых функций – они перестают общаться, развивается апраксия движений рук (вместо целенаправленных движений возникают стереотипные движения, напоминающие мытье рук).

Это моногенное заболевание связанное с Х-сцепленным геном MECP2. Однако, не во всех случаях заболевания находились мутации внутри этого гена. Тогда этим детям было проведено МК и оказалось, что у подавляющего большинства этих детей были найдены микроделеции гена МЕСР2 целиком и прилежащих к нему участков (10 делеций).

Ретроспективно были выявлены клинические особенности микроделеционного варианта с. Ретта (OMIM 312750). Это: стертые проявления с. Ретта, низкая масса тела при рождении, наличие дополнительных клинических признаков (за счет различных прилежащих участков генов, вовлеченных в делецию) – аномалий развития различных органов и микроаномалий (гемангиомы на коже спины, пигментые пятна «брызги грязи», гипоплазия червя мозжечка, кистозная трансформация заднего эпидурального пространства в грудном отделе).

Моногенные заболевания, возникающие в результате интрагенных микроделеций или микродупликаций

Синдром ATRX (OMIM 301040)

Интрагенная дупликация с 31 по 34 экзоны гена ATRX.

Фенотип: ЗПМР, симптомокомплекс детского аутизма, хроническое аффективное расстройство, симптоматическая эпилепсия, плоский рот, большой язык.

Случаи с. Николаидес-Барайцера, связанные с интрагенными микроделециями в гене SMARCA2 (9р.24.3) (OMIM 601358)

Размеры делеции варьируют от 13,6 тыс. до 88 тыс. п.н.

Фенотип: снижение интеллекта, низкий рост, треугольная форма лица, густые брови и ресницы, расширяющийся книзу нос с толстыми крыльями и открытыми вперед ноздрями, большой рот, тонкая верхняя и толстая нижняя губы, провисание кожи под орбитами, редкие тонкие волосы, широкие дистальные фаланги. Дети приветливы и улыбчивы.

Случаи интрагенной перестройки в гене FMR1 у девочек со снижением интеллекта (синдром умственной отсталости, сцепленной с ломкой хромосомой Х (OMIM: 300624))

При синдроме ломкой хромосомы Х, мутация носит особый характер – это экспансия тринуклеотидных повторов в промоутере гена FMR1, и только 1% больных имели внутригенные мутации в кодирующей части гена (все девочки).

Диагностика болезней импринтинга

Б-ни импринтинга очень часто бывают связаны с потерей гетерозиготности (изодисомия) отдельных участков хромосом.

Синдромы Сильвера-Рассела и Беквита-Видемана (11р15.5)

При материнской изодисомии развивается с. Сильвера-Рассела: низкий рост, треугольное лицо, рот «скобкой вниз», асимметрия конечностей, кофейные пятна.

При отцовской изодисомии развивается с. Беквита-Видемана: макросомия, висцеромегалия, грыжа пупочного канатика, «насечки» на мочках, снижение интеллекта.

Синдромы Прадера-Вилли и Ангельмана (15q11.2)

Если отсутствует отцовский участок 15q из-за материнской изодисомии или отцовской микроделеции, развивается с. Прадера Вилли: ожирение, умственная отсталость, гипогенитализм у мальчиков, мелкие черты лица, маленькие кисти и стопы, гипотония мышц.

Если отсутствует материнский участок, развивается с. Ангельмана: эпилепсия, аутизм, тяжелая умственная отсталость, улыбка на лице и нарушение координации движений (резкие движения), поэтому заболевание еще носит название «с-м счастливой куклы».

Генотип: сегментная потеря гетерозиготности или унипарентальная дисомия длинного плеча хромосомы 15, локализованная в критическом участке синдромов Прадера-Вилли и Ангельмана.

Выявление мозаичных форм геномных аномалий

В отличие от регулярных форм часто встречающихся заболеваний, мозаичные формы характеризуются наличием мутаций не во всех, а только лишь части клеток. В связи с этим клинические проявления заболеваний стерты, протекают легче и без МК диагностировать их невозможно.

Выявление множественных геномных аномалий

Сочетание синдромов Клайнфельтера, делеции 1р36 и с. Паллистера-Киллиана.

Ребенок сочетал в себе фенотипически проявления всех аномалий и без применения МК выявить их бы не удалось.

От с. Клайнфельтера: повышенные параметры физического развития.

От с. 1р36: микробрахицефалия, судороги, гипоплазия средней части лица.

От с. Паллистера-Киллиана: редкие волосы в области лба, редкие брови и ресницы, выступающий лоб, гипертелоризм, тонкая верхняя губа и выступающая нижняя, полные щеки, короткий нос с открытыми вперед ноздрями, короткая шея, полосы гипопигментации на коже, нарушения зрения, порок сердца.

Сочетание делеции гена CDKL5 (неонатальная эпилептическая энцефалопатия) и микроделеции 15q11.2 (с. Ангельмана)

Фенотип: сочетание умственной отсталости, аутизма, микробрахицефалии, приступов смеха, движений «механической куклы».

Терапевтическая коррекция, основанная на данных геномных исследований

Обоснование применения препаратов цинка в случаях микроделеции, захватывающей ген ССК

Микроделеция захватывает ген ССК, который кодирует белок предшественник холецистокинина, экспрессируется в тканях головного мозга и кишечника и является регулятором метаболизма цинка.

Фенотип: с-м Аспергера, хронический панкреатит, крупные оттопыренные ушные раковины, гипотелоризм, массивный подбородок, уровень Zn в крови ниже нормы.

Ребенку был назначен лактат цинка и через некоторое время было отмечено улучшение функции кишечника, а также улучшение адаптации ребенка в детском коллективе.

Возможность медико-генетического прогноза в семьях с геномными аномалиями

Если один из родителей является носителем сбалансированной аномалии, высоки риски рождения детей с несбалансированной аномалией генома.

Часто за МК обращаются семьи, в которых уже есть один больной ребенок или более. Нередко в этих семьях часто встречаются самопроизвольные выкидыши. Своевременное проведение молекулярного кариотипирования позволяет выявить сбалансированные аномалии у родителей, прогнозировать риск рождения больных детей и при помощи предимплантационной генетической диагностики, дать возможность родиться здоровому ребенку.

Мозаицизм по геномным аномалиям у родителя может сопровождаться наличием патологического клона клеток в гонадах (тогда как большинство клеток нормальны, а фенотипически родитель здоров). Гонадный мозаицизм в этом случае может стать причиной развития некоторых геномных аномалий. Дети могут родиться очень тяжелыми с сочетанием множественных делеций и дупликаций (с-м Корнелия де Ланге, микродупликация короткого плеча хромосомы 5). Эти проявления часто сложно интерпретировать.

Геномные аномалии у пациента, часто больше, чем родительские. Они имеют склонность к экспансии и вовлечению большего числа генов. Поэтому при обнаружении аномалии у родителя, желательно рекомендовать ПГД, поскольку эти ситуации не столь редки и могут сопровождаться рождением очень тяжелых детей.

Эффекты импринтинга (влияние пола родителя на заболевания, которые могут проявиться у потомства) при прогнозировании играет большую роль, поскольку болезнь будет проявляться только при наследовании геномной аномалии от конкретного пола и риск для будущих беременностей может достигать 50%. У родителя, в свою очередь, она не проявляется из-за наследования от другого пола.

Микроделеции и микродупликации, сцепленные с хромосомой Х, унаследованные от здоровой матери – это 50% риск передачи заболевания потомству, особенно сыновьям.

Инактивация Х-хромосомы у здоровых матерей носительниц мутации

Фенотип матерей-носительниц дупликаций практически нормальный из-за выраженного сдвига Х-инактивации от 85 до 100% с преимущественной инактивацией хромосомы с дупликацией. Эта инактивация не является случайной, начинается еще в период эмбрионального развития женщиной и является борьбой, направленной против аномалии.

Критерии клинической значимости выявленных геномных аномалий

* Большой размер. Граница 400 п.н. – если больше, то однозначно патогенная аномалия, если меньше, то необходимо сравнивать фенотип и генотип ребенка, искать данные литературы, указывающие на аналогичные фенотипические проявления при подобных мутациях.

* Низкая частота в популяции. Существует большое количество геномных аномалий, которые часто встречаются и не являются причиной развития заболевания у потомства (нормальные геномные вариации). Они собраны в специальные базы, и перед заключением молекулярный генетик проверяет наличие аномалий по базе.

* Возникновении аномалии de novo в семье.

Показания к молекулярному кариотипированию

* Комплекс аномалий развития, не являющийся специфичным для известных генетических синдромов.

* Несиндромальная умственная отсталость.

* Расстройства аутистического спектра.

* Клинические проявления моногенного заболевания у больного, у которого не обнаружено мутаций в соответствующем гене молекулярно-генетическими методами.

* Болезни импринтинга.

Вопросы

Следует ли обследовать беременную женщину при наличии умственной отсталости у старшего сына?

Необходимо было начинать обследование сына до наступления беременности. Сейчас времени очень мало, поэтому желательно сразу провести пренатальную диагностику и исследовать плод, можно одновременно со старшим сыном и сравнить результаты.